Análisis basado en impedancia celular para la monitorización de procesos celulares en tiempo real

Resumen

Fuente: Labadie, T., et al., Monitoreo de la supervivencia del virus de la influenza fuera del huésped mediante análisis celular en tiempo real. J. Vis. Exp. (2021)

En este video, demostramos el proceso de monitoreo en tiempo real de eventos celulares, incluida la proliferación de células adherentes, a través de un ensayo de impedancia celular. Aquí, las celdas adherentes actúan como aislantes, restringiendo el flujo de corriente entre los electrodos y aumentando la impedancia.

Protocolo

NOTA: Durante todos los experimentos, mantenga las placas sobre superficies no electrostáticas en todo momento, como las envolturas de papel del embalaje. Siga la sección 1 a continuación para determinar la concentración más apropiada de células que se sembrarán en la placa de microtitulación electrónica (diseñada como E-Plate).

1. Determinación de la cantidad de células apropiadas para infectar células

1. Preparar células MDCK (Madin-Darby Canine Kidney) en matraces de^{75 cm2} para obtener células recién partidas (aproximadamente 80% de confluencia) 24 h antes del experimento.
2. Lave las células con 5 mL de PBS 1x y sepárelas añadiendo 3 mL de solución de tripsina-EDTA al 0,25%.
3. Agregue 7 mL de medio de cultivo celular fresco y cuente las células usando un contador de células automatizado con tinción con azul de tripán.
4. Ajuste la concentración celular a 400.000 células/mL con medios de cultivo celular. Realice diluciones en serie dobles en tubos adicionales para obtener densidades de celdas de 200.000; 100,000; 50,000; 25,000; 12,500; y 6.250 células/mL. Ajuste el rango de dilución de las células según el tipo de célula y su comportamiento de crecimiento.
5. Deje la placa E (Tabla de Materiales) en RT durante varios minutos y añada 100 μL de medio de cultivo celular a cada pocillo utilizando una pipeta multicanal. No toque los electrodos de la placa electrónica.
6. Desbloquee las cunas e inserte el extremo frontal de la placa en el bolsillo de la cuna del instrumento de medición de impedancia (Tabla de materiales). Cierre la puerta de la incubadora.
7. Abra el software.
   1. En "Configuración predeterminada del patrón de experimento", elija la(s) base(s) seleccionada(s) y haga doble clic en la página superior, luego ingrese el nombre del experimento. Haga clic en "Diseño" e ingrese la información de muestra necesaria para cada pocillo seleccionado de la placa; luego, haga clic en "Aplicar" cuando haya terminado. Haga clic en "Programar" | "Pasos" | "Agregar un paso". El software añade automáticamente un paso de 1 s para medir la impedancia de fondo (CI).
   2. Haga clic en "Iniciar/Continuar" en la pestaña "Ejecutar", haga clic en "Trazar", agregue todas las muestras seleccionando los pozos apropiados y asegúrese de que el IC esté entre -0,1 y 0,1 antes de continuar con el siguiente paso.
8. Retire la placa de la base.
9. Agregue 100 μL de cada suspensión celular del paso 1.4 por duplicado a los pocillos apropiados y 100 μL de medios celulares en los pocillos utilizados como controles. Deje la placa E en la campana de flujo laminar durante 30 minutos en RT para permitir una distribución uniforme de las celdas en el fondo de los pocillos.
10. Inserte la placa E en el bolsillo de la cuna. Haga clic en "Programar" | "Agregar paso" en el software e ingrese los valores para monitorear las celdas cada 30 minutos durante 200 repeticiones. A continuación, seleccione "Iniciar/Continuar".
11. Verifique y trace los datos de CI haciendo clic en el botón "Trazar" en el software. Seleccione la concentración de células que se encuentran justo antes de la fase estacionaria 24 h después de la siembra en la placa, para obtener células que aún están en fase de crecimiento durante la infección viral. La fase estacionaria se alcanza cuando la IC está en su máximo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
E-Plate 16 (6 placas)	ACEA Biociencias, Inc	5469830001	Las placas electrónicas están disponibles en diferentes envases
PBS 1X	Tecnologías de la vida (gibco)	14040091
TPCK-Tripsina	Worthington	LS003740
xCELLigence Instrumento de análisis de células en tiempo real S16	ACEA Biociencias, Inc	380601310	Los instrumentos xCELLigence RTCA S16 están disponibles en diferentes formatos (16 pocillos, 96 pocillos, placa simple o múltiple)
Matraz de cultivo de tejidos de 75 cm2	halcón	430641U
MEM 1X	Tecnologías de la vida (gibco)	31095029