Ensayo celular basado en impedancia para medir la multiplicidad de la infección por el virus de la influenza

Resumen

Fuente: Labadie, T., et al., Monitoreo de la supervivencia del virus de la influenza fuera del huésped mediante análisis celular en tiempo real. J. Vis. Exp. (2021)

En este video, discutimos la correlación entre el CIT₅₀ y la multiplicidad de infecciones virales. Las células infectadas por el virus muestran efectos citopáticos, causando su muerte y desprendimiento del microelectrodo de oro, lo que a su vez, reduce la impedancia.

Protocolo

1. Correlación entre los valores de CIT₅₀ y la multiplicidad de infecciones

1. Agregue 100 μL de medio de cultivo MEM estéril 1x en cada pocillo de la placa E. Inserte la placa E en el bolsillo de la cuna del instrumento a 35 °C.
2. Mida el fondo como se describe:
3. Abra el software.
   1. En "Configuración predeterminada del patrón de experimento", elija la(s) base(s) seleccionada(s) y haga doble clic en la página superior, luego ingrese el nombre del experimento. Haga clic en "Diseño" e ingrese la información de muestra necesaria para cada pocillo seleccionado de la placa; luego, haga clic en "Aplicar" cuando haya terminado. Haga clic en "Programar" | "Pasos" | "Agregar un paso". El software agrega automáticamente un paso de 1 s para medir la impedancia de fondo (CI).
   2. Haga clic en "Iniciar/Continuar" en la pestaña "Ejecutar", haga clic en "Trazar", agregue todas las muestras seleccionando los pozos apropiados y asegúrese de que el CI esté entre -0,1 y 0,1 antes de continuar con el siguiente paso.
4. Retire la placa E de la base.
5. Siembre 3 x 10^{4 células} MDCK recién partidas en cada pocillo de la placa de microtitulación electrónica y cultive durante 24 horas a 35 °C con 5% de CO₂ para que estén en una fase replicativa durante la infección por IAV.
6. Infecte las células MDCK con diferentes diluciones de 10 veces de un título conocido de 6log₁₀TCID₅₀/mL del virus H1N1, utilizando el pipeteo inverso para la reproducibilidad siguiendo los pasos a continuación:
   1. Enjuague las células MDCK 2 veces con 100 μL de MEM sin FCS (medio de propagación de virus). Tenga en cuenta que debe eliminar todos los medios después del segundo lavado para evitar una mayor dilución del inóculo.
   2. Añadir 100 μL de suspensión viral en cada pocillo utilizando una pipeta monocanal. Para evitar la contaminación, proceda comenzando de izquierda a derecha, luego de arriba a abajo en la placa mientras cubre los pozos restantes con la tapa.
   3. Inserte la placa en el bolsillo de la cuna del instrumento a 35 °C. Sea cuidadoso para evitar movimientos bruscos que puedan provocar contaminación.
   4. Comience a monitorear la impedancia de la celda cada 15 minutos durante al menos 100 h como se describe:
      1. Inserte la placa E en el bolsillo de la cuna. Haga clic en "Programar" | "Agregar paso" en el software e ingrese los valores para monitorear las celdas cada 30 minutos durante 200 repeticiones. A continuación, seleccione "Iniciar/Continuar".
   5. Después de los dos ciclos de mediciones (es decir, 30 minutos), detenga el aparato haciendo clic en "Pausa" en la pestaña "Ejecutar" y retire la placa E de la base.
   6. Agregue 1 μg/mL de TPCK-tripsina al medio de propagación del virus para escindir la hemaglutinina viral.
   7. Añada 100 μL de medio de propagación del virus que contenga TPCK-tripsina en cada pocillo e inserte la placa E en el bolsillo de la cuna.
   8. Haga clic en "Iniciar/Continuar" en la pestaña "Ejecutar".
      nota: No olvide crear un control negativo correspondiente a las células infectadas simuladas reemplazando la suspensión viral con medios de propagación del virus.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
E-Plate 16 (6 placas)	ACEA Biociencias, Inc	5469830001	Las placas electrónicas están disponibles en diferentes envases
MEM 1X	Tecnologías de la vida (gibco)	31095029
TPCK-Tripsina	Worthington	LS003740
xCELLigence Instrumento de análisis de células en tiempo real S16	ACEA Biociencias, Inc	380601310	Los instrumentos xCELLigence RTCA S16 están disponibles en diferentes formatos (16 pocillos, 96 pocillos, placa simple o múltiple)