Ensayo cinético de supervivencia basado en impedancia celular para evaluar la supervivencia del virus

Resumen

Fuente: Labadie, T. et al., Monitoreo de la supervivencia del virus de la influenza fuera del huésped mediante análisis celular en tiempo real. J. Vis. Exp. (2021).

Este video describe una técnica basada en impedancia celular para estudiar la cinética de supervivencia de los virus que inducen efectos citopáticos. El método mide la impedancia eléctrica de las células adherentes infectadas por el virus pretratadas con solución salina.

Protocolo

1. Preparación de reactivos y materiales de partida

1. Preparación de células MDCK y medio de cultivo celular estéril
   1. Cultive células de riñón canino Madin-Darby (MDCK) en medio de Eagle modificado (MEM) suplementado con un 10% de suero fetal de ternero (FCS) inactivado por calor y antibióticos (100 unidades/mL de penicilina, 100 mg/mL de estreptomicina).
   2. Después de la descongelación, deje pasar las células MDCK al menos 2 veces antes de infectarlas para garantizar una recuperación completa (pero menos de 30 pasadas para evitar cualquier deriva en los fenotipos celulares).
   3. Siembre^un matraz o matraces de cultivo de tejidos de 75 cm2 que contengan 30 mL de MEM estéril 1x con 7,5 x 10⁶ células MDCK e incube a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO₂.
2. Preparación de equipos de monitoreo de impedancia
   1. Coloque el instrumento en la incubadora a 35 °C y deje que se caliente durante al menos 2 h.
   2. Conéctelo a la unidad de control colocada fuera de la incubadora.
   3. Proceda con los procedimientos de limpieza recomendados por el fabricante antes de comenzar el resto del experimento.
3. Producción de existencias de IAV en células MDCK
   1. Para propagar y amplificar los virus H1N1, se siembraron 7,5 x 10^{6 células} MDCK en dos matraces de cultivo de tejidos de 75^cm2 e incubar durante 24 h a 37 °C hasta alcanzar una confluencia del 90%-100%.
   2. Decantar el medio de cultivo celular a partir de la monocapa celular en^{matraces de 75} cm2. Lave las células con 5 mL de PBS estéril 1x.
   3. Retire el PBS y añada 5 ml de 1x PBS para volver a lavar las células.
   4. Etiquete un matraz como control y retire el PBS antes de añadir 15 mL de medio de propagación del virus (1x MEM con 0% de FCS) con cuidado sobre la monocapa. Incubar este matraz en una incubadora mantenida a 35 °C con 5% de CO₂. Úselo para comparar después de 3 días de propagación.
   5. Descongele un vial de caldo de IAV en RT. Diluya el virus hasta la concentración adecuada en un tubo de 1,5 mL que contenga medios de propagación del virus (1x MEM con 0% de FCS).
   6. Retire 1x PBS del matraz de 75^cm2 e infecte las células MDCK con una multiplicidad de infección (MOI) de 1 x ^10-3 o 1 x ^10-4 unidades formadoras de placas por célula (ufp/célula) añadiendo 1 mL del virus diluido a la monocapa celular.
   7. Adsorber el virus en las células MDCK durante 45 min en RT agitando el matraz regularmente cada 15 min.
   8. Retire suavemente el inóculo y añada 15 mL de medio de propagación del virus por matraz que contenga 1 μg/mL de TPCK-tripsina (tripsina/L-1-tosilamida-2-feniletil clorometil cetona), para escindir la hemaglutinina viral HA0 en subunidades HA1 y HA2 (un evento necesario para la fusión de HA con la membrana endosomal y la liberación del genoma viral).
   9. Incubar los matraces a 35 °C y 5% de CO₂ durante al menos 3 días para replicar el virus.
   10. Observe las células MDCK bajo un microscopio con un aumento de 40x y busque los efectos citopáticos (CPE) en las células (comparándolas con el matraz de control celular). Si el CPE no está completo (es decir, alrededor del 80% de las células se desprenden del sustrato), vuelva a colocar los matraces en la incubadora durante 24 horas adicionales.
   11. Una vez finalizado el CPE, decantar el sobrenadante del cultivo celular y centrifugar a 300 x g durante 10 min para pellet los restos celulares.
   12. Transfiera el sobrenadante clarificado a un tubo de 15 mL y los virus de progenie alícuotas a viales criogénicos estériles de un solo uso. Coloque inmediatamente los tubos criogénicos a -80 °C para congelar y almacenar virus.
4. Infecte las células MDCK con diferentes diluciones de 10 veces de un título conocido de 6 log₁₀ TCID₅₀/mL del virus H1N1, utilizando el pipeteo inverso para la reproducibilidad siguiendo los pasos a continuación:
   1. Enjuague las células MDCK 2 veces con 100 μL de MEM sin FCS (medio de propagación de virus). Tenga en cuenta que debe eliminar todos los medios después del segundo lavado para evitar una mayor dilución del inóculo.
   2. Añadir 100 μL de suspensión viral en cada pocillo utilizando una pipeta monocanal. Para evitar la contaminación, proceda comenzando de izquierda a derecha y luego de arriba a abajo en la placa mientras cubre los pozos restantes con la tapa.
   3. Inserte la placa en el bolsillo de la cuna del instrumento a 35 °C. Sea cuidadoso para evitar movimientos bruscos que puedan provocar contaminación.
   4. Comience a monitorear la impedancia de la celda cada 15 minutos durante al menos 100 h como se describe en el paso 2.10.
   5. Después de los dos ciclos de mediciones (es decir, 30 minutos), detenga el aparato haciendo clic en "Pausa" en la pestaña "Ejecutar" y retire la placa E de la base.
   6. Agregue 1 μg/mL de TPCK-tripsina al medio de propagación del virus para escindir la hemaglutinina viral.
   7. Añada 100 μL de medio de propagación del virus que contenga TPCK-tripsina en cada pocillo e inserte la placa E en el bolsillo de la cuna. 8. Haga clic en "Iniciar/Continuar" en la pestaña "Ejecutar".
      nota: No olvide crear un control negativo correspondiente a las células infectadas simuladas reemplazando la suspensión viral con medios de propagación del virus.

2. Cinética de supervivencia de IAV

1. Exponga el IAV a agua destilada salina a 35 °C y pruebe su infectividad a lo largo del tiempo midiendo la disminución de la impedancia celular.
   1. Preparar agua destilada salina añadiendo NaCl hasta una concentración final de 35 g/L en agua destilada. Añadir 900 μL de agua salina en criotubos de 2 mL.
   2. Añadir 100 μL de caldo viral en agua salina y colocar los criotubos en una incubadora (35 °C, 5% CO₂) durante 1 h, 24 h o 48 h.
   3. Siembre 100 μL (que contiene 3 x 10⁴) de células MDCK recién divididas en una placa de microtitulación de 16 pocillos y crezca durante 24 h a 37 °C y 5% de CO₂.
   4. Infectar las células con 100 μL de virus expuestos (previamente diluidos 10 veces en medios de cultivo) utilizando el método de pipeteo inverso para su reproducibilidad repitiendo la sección 1.4.
2. Controle la impedancia de la celda cada 15 minutos durante al menos 100 h.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0.25% Tripsina	ThermoFisher	25200056
Matraz de cultivo de tejidos de 75 cm2	halcón	430641U
E-Plate 16 (6 placas)	ACEA Biociencias, Inc	5469830001	Las placas electrónicas están disponibles en diferentes envases
Fcs	Tecnologías de la vida (gibco)	10270-106
MEM 1X	Tecnologías de la vida (gibco)	31095029
PBS 1X	Tecnologías de la vida (gibco)	14040091
Penicilina-Estreptomicina	Tecnologías de la vida (gibco)	11548876
TPCK-Tripsina	Worthington	LS003740
xCELLigence Instrumento de análisis de células en tiempo real S16	ACEA Biociencias, Inc	380601310	Los instrumentos xCELLigence RTCA S16 están disponibles en diferentes formatos (16 pocillos, 96 pocillos, placa simple o múltiple)