Ensayo de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico para evaluar el estrés oxidativo en suero humano

Resumen

Fuente: Borges, C. R. et al., Evaluación del estrés oxidativo en muestras biológicas utilizando el ensayo de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico. J. Vis. Exp. (2020)

Este video muestra el ensayo de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS) para evaluar el estrés oxidativo en muestras biológicas.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las pautas institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local

1. Ensayo TBARS

NOTA: Una vez que se inicia el ensayo TAPS, debe terminarse sin parar.

1. Tomar tantas muestras como patrones centrifugados a 1500 x g durante 10 min a 4 °C. Después de la centrifugación, mantenga los tubos de vidrio que contienen las muestras y los patrones en tubos de vidrio RT. según sea necesario para el número de muestras a analizar y etiquételos con los nombres de las muestras. A continuación, añada 100 μL de cada muestra preparada (lisados de células HepG2, lipoproteínas de baja densidad, suero humano) a cada tubo de vidrio.
2. Añada 200 μL de SDS al 8,1% a cada muestra y estándar y agite suavemente el tubo de vidrio con movimientos circulares para mezclar la muestra.
3. Añadir 1,5 mL de tampón de acetato de sodio de 3,5 M (pH = 4) a cada muestra y patrón.
4. Añadir 1,5 mL de tampón de acetato de sodio de 3,5 M (pH = 4) a cada muestra y patrón.
5. Lleve el volumen final a 4 mL para cada muestra y estándar agregando 700 μL de agua desionizada.
6. Tape herméticamente cada tubo de vidrio e incube en un bloque calefactor ajustado a 95 °C durante 1 h. Cubra los tubos de vidrio con papel de aluminio para evitar la condensación en la parte superior de los tubos.
7. Retire los tubos de vidrio del bloque calefactor e incube en hielo durante 30 minutos.
8. Centrifugar muestras y patrones a 1500 x g durante 10 min a 4 °C. Después de la centrifugación, mantenga los tubos de vidrio que contienen las muestras y los patrones en RT.
   nota: Mantener las muestras en hielo o a 4 °C hará que toda la muestra o el patrón precipiten.
9. Inmediatamente después de la centrifugación, alicuone 150 μL de sobrenadante de cada tubo y colóquelo en un pocillo separado de una placa de 96 pocillos.
10. Retire las burbujas de cada pocillo con una punta de pipeta.
    nota: La presencia de burbujas producirá lecturas de absorbancia inconsistentes, lo que conducirá a una alta imprecisión del ensayo.
11. Lea las absorbancias a 532 nm. Reste la lectura de absorbancia promedio de las muestras en blanco de todas las demás lecturas de absorbancia.
12. Cree una curva estándar trazando las lecturas de absorbancia sustraída en blanco a 532 nm frente a la concentración conocida de cada estándar. Ajuste los puntos de datos mediante regresión lineal. Calcule concentraciones de muestras desconocidas utilizando la ecuación de la línea de regresión lineal obtenida de la curva estándar.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1x PBS estéril pH 7,4 1 L	VWR, PA	101642--262	Reactivo de lisis celular
Tubo centrífugo autónomo de 50 mL	Corning, Nueva York	CLS430897	Material general
Placa de 96 pocillos, sin tratar, transparente, con tapa, no estéril	Thermo Fisher Scientific, MA	280895	Para medir la absorbancia
Dispositivo de filtro centrífugo de espín Amicon Ultra-0.5 100 kD	Fisher Scientific, NH	UFC510024	Purificación de LDL
Tapones para tubos de vidrio	Thermo Fisher Scientific, MA	14-930-15D	Para el ensayo TBARS
Cloruro de cobre II	SIGMA, MO	222011-250G	Para inducir la oxidación
Tubos de cultivo, Desechables, con tapón de rosca, Vidrio de borosilicato (13 x 100 mm)	VWR, PA	53283-800	Para el ensayo TBARS
Medio Esencial Mínimo de Eagle (EMEM)	ATCC, VA	HB-8065	Medios de células HepG2
Tubos Eppendorf Safe-Lock, 1,5 mL	eppendorf, Nueva York	22363204	Material general
Tubos Eppendorf Safe-Lock, 2,0 ml	Sceitific de Genesee, CA	22363352	Material general
Suero fetal bovino Fuente de EE. UU	Omega Scientific, CA	FB-11	Para cultivo celular
Ácido Acético Glacial	SIGMA, MO	27225-1L-R	Reactivo TBARS
Cóctel de inhibidores de la proteasa Halt (100x)	Thermo Scientific, MA	87786	Reactivo de lisis celular
HEPES	SIGMA, MO	H3375-250G	Disolvente LDL
Ácido clorhídrico (HCl)	Fisher Scientific, NH	A144-212	Reactivo de lisis celular
Centrífuga Legend Micro 17	Thermo Scientific, MA	75002431	Material general
Lipoproteína de Baja Densidad, Plasma Humano	Investigación y Tecnología de Atenas, GA	16-12-120412	Prototipo de matriz biológica
Barras agitadoras magnéticas, Octagon 6-Assort	VWR, PA	58948-025	Material general
Malondialdehído bis (acetal dimetilo)	SIGMA, MO	8207560250	Estándar TBARS
Espectrofotómetro de microplacas Multiskan Go	Fisher Scientific, NH	51119200	Para medir la absorbancia
NP-40	EMD Millipore Corp, MA	492016-100ML	Reactivo de lisis celular
cloruro de sodio	SIGMA, MO	S7653-1KG	Reactivo de lisis celular
Dodecil sulfato de sodio (SDS)	SIGMA, MO	436143-100G	Reactivo TBARS
hidróxido sódico	SIGMA, MO	367176-2.5KG	Reactivo TBARS
Concentrador SpeedVac	Thermo Scientific, MA	SC250EXP	Para la concentración de lisados celulares
Ácido tiobarbitúrico	SIGMA, MO	T5500-100G	Reactivo TBARS
Base TRIS	Fluka, GA	93362	Reactivo de lisis celular

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