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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación
- Agregue 5 mL de Penicilina/Estreptomicina (10000 U/mL) y 5 mL y 10 mL de suplementos disponibles comercialmente a 500 mL de medio clásico completo con suero. Alícuota 50 mL del medio inicialmente.
nota: No devuelva ningún medio a la culata para evitar la contaminación.
- Pon una alícuota del medio clásico completo en hielo.
- Use etanol al 70% para limpiar el microscopio de disección, las pinzas y las tijeras.
- Prepare dos placas de cultivo celular (10 cm), una en el microscopio de disección y otra en hielo; ponga 10 mL de medio clásico completo en cada placa.
2. Pasos experimentales (Figura 1)
- Sacrificio de ratones C57BL/6J alrededor del (P) 20 postnatal utilizando 75-100 mg/kg de ketamina y 7,5-10 mg/kg de xilacina inyectada por vía intraperitoneal. Mantenga los ojos en medio clásico completo en hielo antes de la disección.
- Extirpar el tejido conectivo (músculo y tejido graso) y el nervio óptico del ojo.
- Utilice una microtijera para cortar circunferencialmente 0,5 mm por detrás del limbo corneal. Retire el complejo córnea/iris, el vítreo y el cristalino.
- Realice una incisión de 1 mm perpendicular al borde cortado hacia el nervio óptico y corte una banda circunferencial de 1 mm de ancho. Separar las regiones central y periférica del complejo. Use fórceps para despegar la retina del complejo RPE/coroides/esclerótica.
- Mantenga la banda periférica de la coroides, en medio clásico completo sobre hielo; aísle el otro ojo y repita el proceso para cortar una segunda banda.
- Corta la banda circular en 6 piezas cuadradas ~iguales (~1 mm x 1 mm).
nota: Nunca toque ningún borde.
- Descongele el extracto de membrana basal (BME) según las instrucciones del fabricante. Agregue 30 μL/pocillo de BME en el centro de cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos. Asegúrese de que la gota de BME forme una cúpula convexa en la parte inferior de la placa sin tocar los bordes.
nota: Descongele el BME durante la noche en un refrigerador. El BME debe estar en el hielo en cualquier momento después de la descongelación.
- Coloque el pañuelo en el centro del BME.
nota: No aplanar el explante de coroides; generalmente, deja que el tejido se expanda dentro del BME. La orientación del tejido (lado escleral hacia arriba o hacia abajo) no afecta el resultado experimental.
- Incubar la placa a 37 °C durante 10 min para que el gel se solidifique.
- Añada 500 μL del medio clásico/pocillo completo.
- Cambie el medio clásico cada dos días (500 μL). La brotación de la coroides se puede observar después de 3 días con un microscopio.
nota: Para el tratamiento con factor de crecimiento, deje morir de hambre al tejido durante 4 h. Diluya un compuesto de prueba en un medio reducido en factor de crecimiento (aumento de 1:200 en lugar de 1:50).
3. Método de cuantificación computarizado SWIFT-Choroid (Figura 2)
NOTA: Se utilizó un método computarizado para medir el área cubierta por los recipientes en crecimiento. Se necesita un complemento de macro para el software ImageJ antes de la cuantificación.
- Abra la imagen de brote de coroides con ImageJ y marque "Imagen |Tipo| 8 bits" con escala de grises.
- Ir a "Imagen | Ajustar | Brillo/Contraste (Ctrl/shift/C)" y optimizar el contraste.
- Utilice la función de varita mágica para delinear y eliminar de la imagen el tejido coroideo que está presente en el centro de los brotes (usando la tecla de acceso directo "F1") (Figura 2A, B).
nota: Establezca la tasa de tolerancia de la varita mágica en 20-30%.
- Elimine el fondo de la imagen con las herramientas de selección libre (Figura 2C). Ir a "Imagen | Ajustar | Umbral (Ctrl/Mayús/T)". Utilice la función de umbral para definir los brotes microvasculares en el fondo y la periferia (Figura 2D).
- Haga clic en "F2" y aparecerá un resumen. Guarde una imagen del área seleccionada haciendo clic en "Guardar". Guárdelo en la misma carpeta que la imagen original para futuras referencias.
- Después de medir un grupo de muestras, copie el registrado para el análisis de datos.
nota: También es posible medir el área (μm²) mediante "Analizar | Establecer escala" usando imágenes con barras de escala.
