Ensayo de actividad del receptor-receptor de estrógeno para detectar la actividad estrogénica de los fitoestrógenos

Resumen

Fuente: Fender, E. et al., Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor β Reporter Assay. J. Vis. Exp. (2021).

Este video describe un ensayo reportero basado en células para determinar la actividad estrogénica de compuestos derivados de plantas. Un compuesto con actividad similar al estrógeno imita su unión a los receptores de estrógeno e impulsa la transcripción de genes de la enzima reportera aguas abajo. La enzima reportera genera bioluminiscencia en una reacción, lo que indica la actividad estrogénica del compuesto.

Protocolo

1. Ensayo de transfección de β del receptor de estrógeno humano

NOTA: Se requiere técnica aséptica y una campana de flujo laminar para el día 1 del protocolo de ensayo.

1. Prepare diluciones de 17(-estradiol para la curva estándar.
   1. Transfiera el medio de recuperación celular y el medio de cribado compuesto (CSM) del almacenamiento en el congelador y descongélelos en un baño de agua a 37 °C.
   2. Etiquete los tubos de microcentrífuga intermedios 1 y 2 (INT1, INT2) y 1-8.
   3. Llene INT1 con 995 μL de CSM, INT2 con 615 μL de CSM, el tubo 1 con 900 μL de CSM y los tubos 2-8 con 600 μL de CSM. Deje el tubo 8 a un lado.
   4. Transfiera 5 μL de 100 μM de caldo de 17β-estradiol a INT1. Deseche la punta. Vórtice.
   5. Antes de cada transferencia, enjuague la pipeta 3 veces y, a continuación, transfiera 10 μL de INT1 a INT2. Deseche la punta.
   6. Enjuague la pipeta 3 veces y, a continuación, transfiera 100 μL de INT2 al tubo 1. Deseche la punta. Transfiera 300 μL del tubo 1 al tubo 2. Repita para los tubos 3 a 7. Deseche 300 μL del tubo 7 en el contenedor de residuos. El tubo 8 es un cero y no recibe estradiol. Las concentraciones finales de los patrones plateados son: 400, 133.3, 44.44, 14.815, 4.938, 1.646, 0.5487 y 0 pM estradiol.
2. Prepare los compuestos de muestra.
   1. Muestras de vórtice.
   2. Tome 4 μL de cada muestra de planta en DMSO y agregue 496 μL de CSM para obtener una solución de DMSO al 0,8%.
3. Descongele rápidamente las células reporteras.
   1. Recupere el tubo de medio de recuperación celular del baño de agua a 37 °C. Desinfectar la superficie exterior con etanol al 70%.
   2. Recupere las células reporteras del almacenamiento de -80 °C y descongele transfiriendo 10 ml del CRM precalentado al tubo de células congeladas.
   3. Cierre el tubo de las pilas reporteras y transfiéralas a un baño de agua a 37 °C durante 5-10 minutos.
   4. Recupere el tubo de Suspensión de Célula Reportera del baño de agua. Invierta el tubo de células varias veces suavemente para romper los agregados de células y producir una suspensión homogénea. Limpie la superficie del tubo con etanol al 70%.
4. Placa de ensayo.
   1. Dispense 100 μL de la suspensión de célula reportera en cada pocillo utilizando una pipeta multicanal.
   2. Dispensar 100 μL de muestras por triplicado en pocillos de ensayo adecuados.
   3. Transfiera la placa a una incubadora de CO₂ al 5% humidificada a 37 °C durante 22-24 h.
5. Descongele el sustrato de detección y el tampón de detección en un refrigerador oscuro durante la noche para prepararse para el día 2.
6. Justo antes del final de la incubación de la placa, retire el sustrato de detección y el tampón de detección del refrigerador y colóquelos en un área con poca luz hasta que se equilibren a RT. Una vez en RT, invierta cada tubo suavemente varias veces para mezclar bien las soluciones.
   1. Inmediatamente antes de que se complete la incubación, vierta todo el contenido del tampón de detección en el tubo del sustrato de detección para crear el reactivo de detección de luciferasa. Mezclar suavemente para no formar espuma.
   2. Una vez completada la incubación, invierta la placa para desechar el contenido en un contenedor de residuos adecuado. Golpee suavemente el plato sobre una toalla de papel absorbente limpia para eliminar las últimas gotas de los pocillos.
   3. Agregue 100 μL del reactivo de detección de luciferasa a cada pocillo. Deje reposar la placa de ensayo en RT durante 15 min. No agite el plato.
7. Cuantifique la luminiscencia utilizando un luminómetro de lectura de placas de 96 pocillos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Pipeta de 1000 μL
Pipeta de 20 μL
Pipeta de 200 μL
Baño de agua a 37 °C
37 °C, incubadora humidificada al 5% de CO2
70% etanol
Balanza analítica
Campana de flujo laminar apta para cultivo celular
Dimetilsulfóxido
Depósito de medios desechable, estéril
Sistema de filtración por goteo
Frascos Erlenmeyer			125 mL y 250 mL
Metanol de grado HPLC
Sistema de ensayo reportero ERβ humano, 1 ensayo en formato de 96 pocillos	Indigo Biosciences	IB00411	Kit de ensayo: analiza 24 muestras más una curva estándar
Liofilizador
Pipeta multicanal
Agitador orbital
Luminómetro de lectura de placas			por ejemplo, Bioteck Synergy HTX
Evaporador rotativo
Matraces de fondo redondo			50 mL y 300 mL
Tubos de microcentrífuga estériles o cubetas de medios multicanal estériles
Puntas estériles			200 μL y 1000 μL
Papel Whatman de grado 1
Bolsas Whirl-pak			Bolsas de polietileno estériles