Transferencia de energía de resonancia de Forster resuelta en el tiempo para monitorear la fosforilación de proteínas en células

Resumen

Fuente: Padros, J. et al., Ensayos de transferencia de energía de resonancia de Förster resueltos en el tiempo para la medición de proteínas STAT fosforiladas endógenas en células humanas. J. Vis. Exp. (2021).

Este video describe el ensayo de transferencia de energía de resonancia de Förster o TR-FRET resuelto en el tiempo para determinar la fosforilación de proteínas endógenas con la ayuda de fluoróforos donantes y aceptores marcados en anticuerpos específicos para una proteína de prueba. Esta técnica está diseñada para medir la fosforilación de las proteínas de prueba en los lisados celulares.

Protocolo

1. Cultivo celular

1. Mantener las células en una incubadora humidificada a 37 °C/5% de CO₂ y cultivar con DMEM suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) (células HeLa y A431) o RPMI suplementado con un 15% de FBS (células U266B1). Cultivar las células hasta que alcancen el 70-80% de confluencia, luego tripsinizarlas y pasarlas o usarlas para los ensayos.
   nota: Los medios de cultivo contenían rojo fenólico. No se llevó a cabo la inanición de suero para ninguna línea celular antes de realizar los ensayos.

2. Valoración de estimuladores o inhibidores mediante el protocolo de ensayo de dos placas con células adherentes

NOTA: Este procedimiento describe cómo determinar las potencias del estimulador o inhibidor generando una curva de concentración-respuesta a partir de una serie de dilución del compuesto de prueba.

1. Siembra de células
   1. Dispense 50 μL de células a la densidad preoptimizada (40.000 células HeLa/pocillo para STAT3 y STAT6; 75.000 células A431/pocillo para STAT5) en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos tratada en el medio de cultivo adecuado. Incubar durante la noche a 37 °C/5% CO₂.
      nota: Es necesario determinar la densidad celular óptima y el tiempo de incubación del cultivo.
2. Diluciones de compuestos problema
   1. Prepare una serie de dilución intermedia 2x de compuesto(s) de prueba diluyendo en serie (diluyentes) (diluciones de intervalo medio logarítmico) a través de 12 pocillos de una placa de polipropileno de 96 pocillos en el medio libre de suero.
      nota: Se recomienda realizar una curva de concentración-respuesta de 12 puntos, con un intervalo medio logarítmico, al menos por duplicado, para obtener una estimación precisa de la EC₅₀ o IC₅₀.
   2. Alternativamente, para compuestos de prueba hidrofóbicos solubles en dimetilsulfóxido (DMSO), realice las diluciones iniciales en DMSO al 100% y luego diluya la serie de diluciones del compuesto en un medio libre de suero.
      nota: La tolerancia del ensayo al DMSO debe establecerse antes de realizar una valoración del compuesto de ensayo en un vehículo con DMSO. Es importante mantener concentraciones iguales de disolvente entre las células tratadas y las no tratadas. Además, cuando se prueban diluciones en serie de compuestos, las concentraciones de disolvente deben permanecer siempre constantes en toda la serie de diluciones.
3. Tratamiento celular
   1. Para la estimulación celular, añadir 50 μL de medio libre de suero solo (células no tratadas) o que contenga el estimulador (2x).
   2. Incubar durante el tiempo preoptimizado a temperatura ambiente (RT) o 37 °C (interferón (IFN) α2b/20 min en RT para STAT3; factor de crecimiento epidérmico (EGF)/10 min en RT para STAT5; interleucina (IL)-4/20 min en RT para STAT6). A continuación, pase a la sección 2.4.
      nota: Es necesario determinar la temperatura óptima de incubación.
   3. Para la inhibición celular, añadir 25 μL de medio libre de suero solo (células no tratadas) o que contenga el inhibidor (4x).
   4. Incubar durante el tiempo preoptimizado a RT o 37 °C (Inhibidor de JAK: 1/30 min a RT para STAT3 y STAT6; Erlotinib/15 min en RT para STAT5).
   5. Añadir 25 μL de medio libre de suero solo (células no tratadas) o que contenga el estimulador (4x) a su EC₈₀.
   6. Incubar durante el tiempo preoptimizado a RT o a 37 °C (las mismas condiciones que para el paso 2.3.2).
4. Lisis celular
   1. Prepare el 1x tampón de lisis suplementado específico del kit según lo indicado por el fabricante.
      nota: Es obligatorio complementar el tampón de lisis 1x con el cóctel de inhibidores de fosfatasa 100x diluido hasta una concentración final de 1x. El tampón de lisis suplementado 1x contiene 1 mM de fluoruro de sodio, 2 mM de ortovanadato de sodio y 2 mM de beta-glicerofosfato. No se requieren otros inhibidores de la fosfatasa y deben evitarse. No se recomiendan tampones de lisis ni inhibidores de la fosfatasa que no sean los incluidos en el kit, ya que podrían contener ingredientes que podrían interferir con la medición.
   2. Retire y deseche con cuidado el medio de cultivo celular aspirando el sobrenadante.
   3. Agregue inmediatamente 50 μL de 1x Tampón de Lisia Suplementado.
      nota: El volumen del tampón de lisis (25-50 μL) se puede optimizar.
   4. Incubar durante 30 min en RT bajo agitación (agitador de placas orbital ajustado a 400 rpm; agitación moderada).
      nota: Se puede optimizar el tiempo de incubación de la lisis (30-60 min). Los lisados pueden utilizarse inmediatamente para la detección de proteínas objetivo o congelarse a -80 °C.
5. Detección TR-FRET
   1. Prepare la mezcla de detección de anticuerpos 4x en tampón de detección 1x según lo indicado por el fabricante.
   2. En este paso de transferencia, pipetee cuidadosamente 15 μL de lisado celular de la placa de cultivo de 96 pocillos a un pocillo de una microplaca blanca de bajo volumen de 384 pocillos.
   3. Añada 15 μL de lisado de control positivo y 15 μL de tampón de lisis 1x (control negativo) a los pocillos de ensayo separados.
   4. Añada 5 μL de mezcla de detección de anticuerpos 4x (Eu-Ab1/FR-Ab2 para la detección de la fosfoproteína o Eu-Ab3/FR-Ab4 para la detección de la proteína total) a cada uno de los pocillos de ensayo.
   5. Cubra la placa con un sellador de placas e incube durante 1 h hasta toda la noche en RT, dependiendo del ensayo (consulte la Hoja de Datos Técnicos correspondiente)
      nota: Es necesario optimizar el tiempo de lectura óptimo para cada ensayo y línea celular. La placa se puede leer varias veces sin que ello afecte negativamente al rendimiento del ensayo.
   6. Retire el sellador de placas adhesivas y lea la placa en un lector de microplacas compatible con TR-FRET.
      nota: Se recomiendan fluorómetros basados en filtros, aunque se pueden usar algunos instrumentos monocromadores. Verifique que esté instalado el módulo óptico adecuado (filtros y espejo) para TR-FRET. Utilice una longitud de onda de excitación de 320 o 340 nm para excitar el quelato de europio. Lea los ensayos a 615 nm (o 620 nm) y 665 nm para detectar tanto la emisión del europio donante como del fluoróforo aceptor, respectivamente. La configuración del instrumento dependerá del lector en particular. Los datos presentados aquí se obtuvieron utilizando excitación basada en lámpara, retardo de 90 μs, tiempo de integración de 300 μs y 100 destellos por pocillo. Sin embargo, el ensayo phospho-STAT4 se leyó utilizando excitación láser para generar relaciones señal-fondo (S/B) más altas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Microplaca de 96 pocillos, transparente, de fondo plano, de poliestireno, tratada con cultivo de tejidos, estéril	Corning	3595	Esta es la placa para cultivar células cuando se utiliza el protocolo de ensayo de dos placas. Se pueden utilizar otras placas de cultivo celular de 96 pocillos
Microplaca de 384 pocillos, blanca, bajo volumen	PerkinElmer	6007290	Esta es la placa para la detección de TR-FRET cuando se utilizan los protocolos de ensayo de dos o una placa. Se pueden utilizar otras placas blancas de 384 pocillos de bajo volumen
Línea celular A431	ATCC	CRL-1555
Sellado de microplaca adhesiva	PerkinElmer	6050185
Medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)	bisonte europeo	319-005-CL	THUNDER TR-FRET es compatible con un medio de cultivo que contiene rojo fenol
Lector de placas multietiqueta EnVision Xcite	PerkinElmer	2104-0020A	Los ensayos se pueden realizar en una variedad de lectores de placas equipados con la opción TR-FRET
Línea celular HeLa	ATCC	CCL-2
Roswell Park Memorial Institute 1640 mediano (RPMI)	bisonte europeo	350-007-CL	THUNDER TR-FRET es compatible con un medio de cultivo que contiene rojo fenol
Tripsina/EDTA 0.05%	bisonte europeo	325-542-CL
Agua ultrapura	Na	Na	Utilice agua de grado Milli-Q (18 MΩ.cm) para diluir el tampón de lisis y el tampón de detección