Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las pautas institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local
1. Aislamiento y cultivo de células progenitoras neurales humanas (hNPCs)
- Coloque el tejido cerebral en una placa de Petri de 100 mm y retire con cuidado las meninges con pinzas.
- Transfiera el tejido cerebral a un tubo cónico de 50 mL y lávelo dos veces con 20 mL de PBS invirtiendo suavemente el tubo.
- Incubar el tejido cerebral en un nuevo tubo cónico de 50 mL sumergiendo el tejido en una solución de disociación celular (ver Tabla de Materiales) y DNasa I (10 U/mL) durante 10 min a 37 °C.
- Agregue 5 mL de medio de cultivo de células neuronales (ver Tabla de Materiales) al tubo que contiene tejido cerebral y disocie mecánicamente las neuroesferas triturando de 20 a 30 veces a través de una punta de pipeta de 1000 μL para hacer una suspensión de una sola célula.
- Filtre la suspensión celular a través de un filtro celular de 70 μm para eliminar los grupos de células.
- Siembre la suspensión unicelular en un matraz T-25 ventilado con 5-10 mL de medio de cultivo de células neuronales suplementado con componentes detallados en la Tabla 1.
- Esterilizar la solución de heparina por filtración a través de un filtro de 0,2 μm. El suplemento B-27 sin vitamina A es un suplemento sin suero para el cultivo de progenitores neurales y células madre sin inducir diferenciación.
nota: Las células progenitoras neurales humanas (hNPC) se aíslan de un cerebro fetal humano recogido de un feto abortado. Después de 7 a 10 días en cultivo, las células madre neurales (NSC) forman colonias de neurosfera que flotan libremente, mientras que otros tipos de células permanecen en suspensión como células individuales o se adhieren al fondo del matraz. Las hNPCs aisladas pueden ser cultivadas como neuroesferas en suspensión durante varios meses.
2. Pasar los hNPCs
- Recoja los medios que contienen las esferas flotantes, neuroesferas grandes y pequeñas, y transfiéralos a un tubo cónico de 50 mL.
nota: Debido a razones desconocidas, el tiempo para dividir las neuroesferas varía de 7 días a 30 días. Sin embargo, en general, las neuroesferas deben ser transitadas cuando alcanzan un diámetro superior a 700-900 μm. Esto es cuando el centro de la neurosfera comienza a oscurecerse, lo que se considera un signo de una alta tasa de muerte celular.
- Girar las neuroesferas por centrifugación a 300-400 x g durante 3 min.
- Aspire cuidadosamente el sobrenadante y luego sumerja las esferas en 500 μL de reactivo de disociación celular descongelado (consulte la tabla de materiales).
- Realice alícuotas del reactivo de disociación celular añadiendo 500 μL por microtubos de 1,5 mL y almacene a -20 °C. Para evitar la pérdida de actividad enzimática, descongele el reactivo de disociación celular manteniéndolo a RT o caliente durante 5 min en un baño de agua/perlas a 37 °C.
- Dependiendo de la densidad y el tamaño de las esferas, incubar las esferas sumergidas a 37 °C durante 5-15 min.
- Añadir 5-10 mL de medio de cultivo precalentado a las neurosferas que contienen un tubo cónico de 50 mL y centrifugar a 300-400 x g durante 5 min para sedimentar las neurosferas.
- Aspirar el sobrenadante y pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo, utilizando una pipeta de 1000 μL, en 2 mL de medio de cultivo hasta que todas las neuroesferas estén en una suspensión unicelular.
nota: La disociación se hará visible a simple vista. Antes de la disociación, las neuroesferas tienen forma de esferas. Después de sumergirse en el reactivo de disociación y pipetear hacia arriba y hacia abajo, se convertirán en células individuales.
- Cuente y sibote las células individuales, de 2 a 3 millones de células por matraz T-25, en 10 ml de medio de cultivo.
- Alimente las células cada 3 días reemplazando la mitad de los medios de cultivo.
- Establezca las neuroesferas inclinando el matraz de modo que quede en su esquina inferior. Mantenga el matraz en la posición durante aproximadamente 1-2 minutos hasta que las neuroesferas se sedimenten. A continuación, aspire la mitad del medio suavemente insertando la pipeta serológica en el medio por encima de las neuroesferas asentadas. Las células disociadas pueden agregarse para formar esferas después de 2 a 3 días en cultivo.
3. Congelando los hNPCs
- Prepare el medio de congelación celular agregando DMSO al medio de cultivo hasta una concentración final del 10% (v/v) o use un medio de criopreservación disponible comercialmente para tipos de células sensibles (consulte la Tabla de materiales).
- Clasifique las esferas grandes transfiriendo el medio a un tubo cónico de 50 ml y dejando que las esferas se asienten por gravedad. A continuación, retire y transfiera las neuroesferas grandes a un nuevo tubo cónico de 50 mL para su paso utilizando una punta de pipeta de 200 o 1000 μL.
nota: Las neuroesferas con un diámetro superior a 900 μm se consideran grandes, y las que tienen un diámetro inferior a 500 μm se consideran pequeñas.
- Centrifugar las neuroesferas restantes a 300-400 x g durante 3 min. Retire con cuidado el sobrenadante.
- Resuspenda hasta 100 esferas en 1 ml de reactivo de criopreservación y transfiéralo a un tubo criogénico.
- Almacene durante la noche a -80 °C en un recipiente de congelación celular (consulte la Tabla de materiales) y transfiéralo a nitrógeno líquido al día siguiente para su almacenamiento a largo plazo.
nota: Es preferible congelar neuroesferas de tamaño pequeño a mediano (menos de 900 μm de diámetro) y evitar congelar neuroesferas de gran tamaño (más de 900 μm de diámetro) o células individuales. Para reducir el daño celular mientras se descongela la muestra, mantenga las células densas sembrando las neuroesferas descongeladas en un pequeño matraz T25.
4. Evaluación de la neurotoxicidad
NOTA: La citotoxicidad de los compuestos de prueba se evalúa en placas de 384 pocillos (ver Tabla de Materiales) utilizando un ensayo de viabilidad de células luminiscentes (ver Tabla de Materiales). Las hNPCs se preparan siguiendo el mismo método, excepto por ligeras modificaciones, descrito en la sección "Diferenciación y tratamiento de las hNPCs". Posteriormente, se mide una señal luminiscente generada por el ensayo de viabilidad de células luminiscentes utilizando un lector de microplacas. La señal luminiscente es proporcional a la concentración celular de ATP, que a su vez es directamente proporcional al número de células viables presentes en cada pocillo.
- capa
- Agregue 30 μL de poli-L-lisina (PLL) por pocillo de una placa de 384 pocillos.
- Incubar durante 1 h en RT.
- Lavar 2 veces con PBS.
- Déjalo secar a RT (durante unos 30 min).
- Agregue 30 μL de laminina (50 μg/mL) por pocillo de una placa de 384 pocillos.
- Incubar durante 2 h a 37 °C.
- Lavar 2 veces con PBS.
nota: Las placas recubiertas de 384 pocillos pueden almacenarse a 4 °C durante 1 mes.
- Recubrimiento de las células
- Cuente y coloque 20.000 neuroesferas unicelulares por pocillo de una placa de 384 pocillos en 25 μL de medio de diferenciación.
- Incubar durante 5 días a 37 °C.
- Después de 5 días, tratar las células durante 24 h con compuestos de prueba preparados a 6 veces la concentración final deseada en un volumen de 5 μL (para hacer un volumen final de 30 μL por pocillo).
- Ensayo de viabilidad celular
- Agregue 30 μL de reactivo de ensayo de viabilidad de celda luminiscente por pocillo de una placa de 384 pocillos.
nota: Agregue un volumen de reactivo de ensayo de viabilidad celular luminiscente igual al volumen presente en cada pocillo. Descongele el reactivo del ensayo de viabilidad de la célula luminiscente y equilibre a RT antes de su uso.
- Agitar en un agitador de platos durante 2 minutos (para mezclar e inducir la lisis celular).
- Centrifugar la mezcla a 300-400 x g durante 30 s.
- Incube la placa de 384 pocillos durante 10 minutos en RT en un lugar protegido de la luz (para estabilizar la señal luminiscente).
- Registre la luminiscencia con un lector de microplacas.
nota: Utilice controles adecuados para el ensayo de viabilidad, incluido Velcade (a una concentración final de 10 μM) como positivo y HBSS que contenga DMSO (con una concentración final de 0,1 % o 0,2 %) como control negativo.
Tabla 1. Componentes necesarios para fabricar 100 mL de medios de cultivo
| importe | componente |
| 100 μL | FEAG (20 ng/mL) |
| 100 μL | FGF (10 ng/mL) |
| 2 mL | B-27, menos vitamina A (50X) |
| 1 mL | L-alanil-L-glutamina (100X) (ver tabla de materiales) |
| 4 μL | Heparina (2 μg/mL) |
| 96.8 mL | Medio de cultivo de células neuronales (ver tabla de materiales) |
