No se han declarado conflictos de interés.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Deslizadores de cubierta circular de 18 mm</td>
			<td>Termo Científico</td>
			<td>CB00180RA</td>
			<td>Esterilizar antes de usar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citocalasina D</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHZ1063</td>
			<td>Disuelto en DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kit Maxi de plásmido EndoFree</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medio de montaje de fluorescencia</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S302380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reactivo de transfección Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehido</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>#6084-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCI FE65</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Véanse las referencias 8 y 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletas PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilina-Estreptomicina</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hidrobromuro de poli-D-lisina</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>espátula</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tripsina-EDTA (0,05%), rojo fenol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ensayo de inmunofluorescencia para evaluar el efecto de las proteínas diana en el crecimiento de neuritas

Fuente: Chan, W., W., R. et al. <a href="https://app.jove.com/v/60031">Un ensayo basado en proteínas de fluorescencia verde mejorada para estudiar el crecimiento de neuritas en neuronas primarias.</a> J. Vis. Exp. (2019).
En este video, demostramos un ensayo de inmunofluorescencia basado en EGFP para identificar la eficacia de las proteínas diana en el crecimiento de neuritas de las neuronas corticales primarias. Las neuronas primarias se transfectan con una proteína fluorescente, EGFP, y una proteína diana, y luego se realiza un inmunoensayo para investigar el efecto de la proteína diana en el crecimiento de las neuritas.

Ensayo de inmunofluorescencia para evaluar el efecto de las proteínas diana en el crecimiento de neuritas

Fuente: Chan, W., W., R. et al. Un ensayo basado en proteínas de fluorescencia verde mejorada para estudiar el crecimiento de neuritas en neuronas primarias. J. Vis. Exp. 
...

Las neuronas en desarrollo extienden los procesos citoplasmáticos de sus cuerpos celulares mediante el crecimiento de neuritas para desarrollar dendritas y axones, que son esenciales para la comunicación de neurona a neurona.
Para estudiar el efecto de una proteína diana en el crecimiento de neuritas, tome una placa multipocillos con un cubreobjetos recubierto de poli-D-lisina en su base. La superficie del cubreobjetos tiene un cultivo adherente de neuronas corticales primarias derivadas del cerebro embrionario de rata.
Trate las neuronas con una mezcla que contenga dos tipos de plásmidos: un plásmido EGFP que codifica una proteína fluorescente verde mejorada y un segundo plásmido que codifica la proteína diana en un reactivo de transfección adecuado.
El reactivo de transfección facilita la entrada de los plásmidos en las células.
Después de la transfección, ambos plásmidos se expresan, produciendo proteínas fluorescentes verdes y proteínas diana. La expresión de EGFP imparte fluorescencia verde a las células cotransfectadas.
Las proteínas diana con potencial estimulante del crecimiento de neuritas inician la señalización celular, lo que promueve la reorganización del citoesqueleto y conduce al desarrollo de proyecciones neuronales y sus extensiones.
Aspire el medio gastado y fije las células con paraformaldehído. Contratiña las células utilizando anticuerpos anti-proteína diana marcados con fluorescencia roja que se unen específicamente a las proteínas diana expresadas e imparten fluorescencia roja adicional a las células.
Retire el cubreobjetos de la placa de cultivo y obsérvelo bajo un microscopio de fluorescencia.
Las células cotransfectadas que exhiben una señal de fluorescencia de dos colores muestran procesos neuronales más largos que las células que carecen de fluorescencia roja, lo que confirma el efecto estimulante de la proteína diana sobre el crecimiento de neuritas.

Después de dos días a 37 grados Celsius y dióxido de carbono al 5%, diluya EGFP y ADN plasmídico de proteína diana y reactivo de transfección en dos tubos separados de 1,5 mililitros, y luego, mézclelos. Transfecte las células con EGFP agregando la mezcla de transfección a los pocillos.
Después de 24 horas, lave las células con PBS a 37 grados Celsius y fíjelas con paraformaldehído al 4% en PBS durante 10 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.
Al final de la incubación, lave las células fijas tres veces con PBS fresco por lavado y agregue un volumen mínimo de medio de montaje de fluorescencia en un portaobjetos de vidrio de microscopio, por muestra. A continuación, transfiera con cuidado los cubreobjetos recubiertos al medio de montaje, con las muestras orientadas hacia los portaobjetos de vidrio.
Para obtener imágenes del crecimiento de neuritas, seleccione el objetivo 40x en un microscopio epifluorescente y haga clic en "Iniciar" para capturar imágenes de al menos 40 neuronas intactas positivas para EGFP por transfección.
Cuando se hayan creado todas las imágenes de los nuevos derechos, abra las imágenes capturadas en ImageJ con el complemento NeuronJ y mida la longitud de la neurita más larga de cada neurona desde el cuerpo celular hasta la punta del cono de crecimiento. Luego, analice los datos obtenidos con el software para determinar el efecto de las proteínas objetivo en el crecimiento de neuritas.

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Investigación

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biological Techniques

Técnicas biológicas

Assay Techniques

Técnicas de ensayo

Immunoassays

Inmunoensayos

Immunofluorescence Assay to Evaluate Effect of Target Proteins on Neurite Outgrowth

993 vistas. Las neuronas en desarrollo extienden los procesos citoplasmáticos de sus cuerpos celulares mediante el crecimiento de neuritas para desarrollar dendritas y axones, que son esenciales para la comunicación de neurona a neurona. Para estudiar el efecto de una proteína diana en el crecimiento de neuritas, tome una placa multipocillos con un cubreobjetos recubierto de poli-D-lisina en su base. La superficie del cubreobjetos tiene un cultivo adherente de neuronas corticales primarias deri...

Ensayo de inmunofluorescencia para evaluar el efecto de las proteínas diana en el crecimiento de neuritas

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Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Deslizadores de cubierta circular de 18 mm	Termo Científico	CB00180RA	Esterilizar antes de usar
Citocalasina D	Invitrogen	PHZ1063	Disuelto en DMSO
Kit Maxi de plásmido EndoFree	QIAGEN	12362
Medio de montaje de fluorescencia	Dako	S302380
Reactivo de transfección Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668019
Paraformaldehido	Sigma-Aldrich	P6148
pEGFP-C1	Clontech	#6084-1
pCI FE65			Véanse las referencias 8 y 15
Tabletas PBS	Gibco	18912014
Penicilina-Estreptomicina	Gibco	15140122
Hidrobromuro de poli-D-lisina	Sigma-Aldrich	P7280
espátula	Sigma-Aldrich	S4147
Tripsina-EDTA (0,05%), rojo fenol	Gibco	25300062