Ensayo de complementación de luciferasa dividida para identificar interacciones específicas proteína-proteína

Abstract

Fuente: Wiertelak, W. et.al., Demostración de Complejos Heterólogos formados por Proteínas de Membrana de Tipo III Residentes en Golgi utilizando el Ensayo de Complementación de Luciferasa Dividida. J. Vis. Exp. (2020)

Este video muestra el ensayo de complementación de luciferasa dividida para detectar interacciones proteína-proteína. En este ensayo, las proteínas de interés se marcan con fragmentos pequeños y grandes de la enzima luciferasa. Cuando las proteínas interactúan, los fragmentos grandes y pequeños se combinan para formar un complejo enzimático activo, que en presencia de un sustrato específico, libera una luminiscencia brillante que se puede medir.

Protocol

1. Transfección transitoria de los plásmidos de expresión en las células

1. Recoseche el cultivo de células HEK293T adherente por tripsinización y vuelva a suspender las células en un medio de crecimiento completo dedicado. Coloque las celdas (2 x 10⁴/100 μL/pocillo) en una placa de 96 pocillos de fondo blanco y fondo transparente. Ajuste el número total de pozos para acomodar todas las combinaciones y controles probados, incluidas las réplicas.
   nota: Intente usar solo los 60 pozos internos de la placa para minimizar los cambios térmicos y evitar la evaporación durante la noche. Se recomienda encarecidamente el uso de placas recubiertas de poli-D-lisina como las indicadas en la Tabla de Materiales, de lo contrario, las células pueden desprenderse durante los pasos de lavado posteriores.
2. Cultivar las células durante la noche en condiciones estándar (37 °C, 5% CO₂).
3. Al día siguiente, transfecte las células con las combinaciones deseadas de plásmidos de expresión.
   1. Diluir los plásmidos de expresión en un medio libre de suero (ver Tabla de Materiales) a 6,25 ng/μL para cada constructo.
   2. Añada el reactivo de transfección a base de lípidos en una proporción adecuada de lípidos a ADN e incube de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   3. Agregue 8 μL de mezcla de lípidos: ADN a los pocillos designados. Mezcle el contenido del plato mediante una rotación suave. Esto da como resultado la transfección de ambos constructos de expresión a 50 ng/pocillo.
4. Cultivar las células durante 20-24 h en condiciones estándar (37 °C, 5% CO₂).
   nota: El cultivo de las células durante más tiempo puede dar lugar a niveles más altos de expresión de proteínas de fusión, lo que puede promover una asociación inespecífica entre los fragmentos.

2. Intercambio medio

1. Al día siguiente, reemplace el medio acondicionado con 100 μL de un medio libre de suero en cada pocillo. Asegúrese de que las células no se hayan desprendido al intercambiar el medio.
   nota: Este paso debe realizarse 2-3 h antes de la adición de la solución de trabajo de furimazina. La retirada del suero minimiza el fondo causado por la autoluminiscencia de la furimazina.

3. Preparación de la solución de trabajo de furimazina

1. Justo antes de la medición, mezcle 1 volumen de furimazina con 19 volúmenes de un tampón de dilución (una dilución de 20 veces).
   nota: El volumen total de la solución de trabajo de furimazina a preparar depende del número de pocillos individuales que se van a analizar (la solución de trabajo de furimazina se añade al medio de cultivo celular en una proporción de 1:5, por lo tanto, a cada pocillo previamente llenado con 100 μL de un medio libre de suero se deben agregar 25 μL de la solución de trabajo de furimazina).
2. Agregue la solución de trabajo de furimazina a los pocillos designados (25 μL/pocillo). Mezcle suavemente la placa a mano o con un agitador orbital (por ejemplo, 15 s a 300-500 rpm).

4. Medición de luminiscencia

1. Inserte la placa en un lector de microplacas de luminiscencia.
   1. Para los experimentos que se van a realizar a 37 °C, equilibre la placa durante 10-15 minutos a la temperatura indicada.
2. Seleccionar los pozos a analizar.
3. Lectura de luminiscencia con un tiempo de integración de 0,3 s. Continúe monitoreando la luminiscencia hasta 2 h cuando sea necesario.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solución de tripsina-EDTA al 0,25%			cultivo celular
Línea celular de mamíferos adherente			cultivo celular
BioCoat Poly-D-Lisina de 96 pocillos Blanco/Transparente Microplaca con tratamiento TC de fondo plano, con tapa	Corning	356651	Artículos de plástico
Centrífuga de cultivo celular			Artículos de plástico
Suplementos de cultivos celulares (suero bovino fetal inactivado por calor, L-glutamina, penicilina, estreptomicina)			cultivo celular
Incubadora de CO2			dispositivo
Plásmidos de expresión que codifican proteínas de interés no marcadas con fragmentos de NanoBiT			Ensayo
Reactivo de transfección FuGENE HD	Promega	E2311	Ensayo
Lector de microplacas GloMax Discover (o un lector de microplacas de luminiscencia diferente)	Promega	GM3000	dispositivo
Medio de crecimiento dedicado a la línea celular utilizada			cultivo celular
Materiales y reactivos para la clonación molecular estándar (bacterias, polimerasa termoestable, enzimas de restricción, ADN ligasa, materiales y reactivos para la purificación de ácidos nucleicos)			Ensayo
Sistema de inicio NanoBiT MCS	Promega	N2014	Este kit contiene vectores que permiten el marcaje de las proteínas de interés con fragmentos de NanoBiT en diferentes orientaciones, así como el plásmido de control que codifica la proteína HaloTag fusionada con SmBiT y un par de plásmidos de control positivo.
Sistema de ensayo de células vivas Nano-Glo	Promega	N2011	Este kit contiene furimazina, que es un sustrato que permite la detección de la actividad de NanoLuc en células vivas, y un tampón de dilución dedicado.
Opti-MEM I Suero Reducido Medio, sin rojo fenol	Gibco	11058021	cultivo celular
Agitador orbital			dispositivo