Ensayo de electroquimioluminiscencia para la cuantificación de los niveles de proteínas diana en el lisado cerebral

>Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE

1. Protocolo MeCP2-ECLIA

1. Preparación de la solución de lavado, el tampón de bloqueo y la solución diluyente del ensayo (día 1)
   1. Agregue 500 μL de Tween 20 a 1 L de PBS para preparar una solución de Tween 20 al 0.05% en PBS, mezcle vigorosamente y etiquételo como "solución de lavado><". nota: Asegúrese de que solo se utilice tampón de lavado recién preparado.
   2. Prepare una solución de bloqueo del bloqueador A al 3% (Tabla de Materiales) en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Mezclar agitando suavemente, filtrar, esterilizar y conservar en la nevera hasta su uso durante un máximo de dos semanas.
   3. Agregue 5 mL de solución de bloqueo a 10 mL de PBS para preparar la solución diluyente del ensayo (1% de bloqueador A en PBS).
2. Recubrimiento de placas de alta ligereza
   1. Saque una placa de alta unión de un solo punto de matriz múltiple de 96 pocillos.
      nota: Las placas de alta unión tienen una mayor capacidad de unión y, por lo tanto, un mayor rango dinámico que las placas estándar con superficies hidrofóbicas.
   2. Descongele el anticuerpo monoclonal anti-MeCP2 de ratón en hielo y mezcle 0,67 μl del anticuerpo con 4 ml de PBS (dilución de anticuerpos 1:6.000 en PBS). Vortex la solución de anticuerpos para mezclar bien y etiquetar el tubo como "solución de recubrimiento".
   3. Dispense cuidadosamente 25 μL de solución de recubrimiento en la esquina inferior de cada pocillo utilizando una pipeta multicanal; esto se denomina método de recubrimiento en solución. Golpee suavemente la placa de 96 pocillos a cada lado para asegurarse de que la solución de recubrimiento cubra el fondo de cada pocillo.
   4. Selle la placa con una lámina adhesiva e incube la placa en el frigorífico a 4 °C durante la noche (12-16 h).
3. Bloqueo (día 2)
   1. Saca el plato de la nevera y retira el papel de aluminio.
   2. Retire la solución de recubrimiento de anticuerpos arrojándola a la papelera y golpee el plato con una toalla de papel para eliminar toda la solución de recubrimiento de los pocillos.
   3. Agregue 125 μL de solución de bloqueo por pocillo. Vuelva a sellar la placa y colóquela en un agitador de microplacas orbital.
   4. Incubar la placa durante 90 min a temperatura ambiente con agitación constante a 800 rpm.
4. Preparación de patrones y muestras
   1. Durante el tiempo de incubación, prepare los patrones de proteínas MeCP2 y/o TAT-MeCP2 y varias muestras.
      nota: El tampón de lisis utilizado para la dilución estándar debe ser el mismo que el utilizado en las muestras analizadas.
   2. Extraiga un vial de solución de masa proteica MePC2 y/o TAT-MeCP2 (250 μg/mL), lisados de cerebro de ratón y lisados de HDF a -80 °C. Descongélelos en hielo.
   3. Diluir la solución madre estándar (MeCP2 y/o TAT-MeCP2) en tubos limpios de acuerdo con la Tabla 1.
   4. Diluya las muestras en tampón de lisis de la siguiente manera: 1-20 μg de lisado de cerebro de ratón por 25 μL de tampón de lisis y 0,25-1 μg de lisado de HDF por 25 μL de tampón de lisis. Prepare suficiente volumen de cada muestra para realizar el análisis por triplicado.
5. Adición de las muestras y soluciones estándar
   1. Retire la solución de obstrucción arrojándola a la papelera y golpee el plato con una toalla de papel para eliminar toda la solución de obstrucción de los pocillos.
   2. Lave la placa 3 veces con 150 μL de solución de lavado agregando la solución de lavado y retirándola inmediatamente.
   3. Agregue 25 ul de patrones y muestras a la esquina inferior del pocillo con una pipeta de un solo canal.
   4. Sellar la placa e incubar la placa durante 4 h a temperatura ambiente con agitación constante a 800 rpm.
6. Anticuerpo de detección sin marcar
   1. Descongele el anticuerpo policlonal de conejo anti-MeCP2 en hielo. Diluir el anticuerpo 1:6.000 en una solución diluyente de ensayo.
   2. Retire los estándares y las muestras arrojándolos a la papelera y golpee el plato con una toalla de papel.
   3. Lave la placa 3 veces con 150 μL de solución de lavado agregando la solución de lavado y retirándola inmediatamente.
   4. Añada 25 μL de anticuerpo de detección no marcado a cada pocillo con la pipeta multicanal. Sellar la placa e incubarla durante 1 h con agitación constante a 800 rpm a temperatura ambiente.
7. Anticuerpo conjugado específico
   1. Saque el anticuerpo secundario específico (Tabla de Materiales) de la nevera y colóquelo en hielo. Diluir el anticuerpo 1:666.67 en una solución diluyente de ensayo y mezclar suavemente.
   2. Retire el anticuerpo secundario libre sin etiquetar arrojándolo a la papelera y golpee el plato con una toalla de papel.
   3. Lave la placa 3 veces con 150 μL de solución de lavado agregando la solución de lavado y retirándola inmediatamente.
   4. Añadir 25 μL de anticuerpo conjugado específico (Tabla de Materiales) a cada pocillo con la pipeta multicanal. Sellar la placa e incubar durante 1 h con agitación constante a 800 rpm a temperatura ambiente.
8. Lectura de la placa
   1. Retire el anticuerpo conjugado libre (Tabla de materiales) arrojándolo a la papelera y golpee el plato con una toalla de papel.
   2. Lave la placa 3 veces con 150 μL de solución de lavado.
   3. Añada a la placa 150 μL de tampón de lectura de oro a base de Tris (Tabla de materiales) con tensioactivo que contenga tripropilamina como correactivo para la generación de luz. Evite las burbujas de aire mediante el uso de técnicas de pipeteo inverso.
   4. Coloque la placa en la plataforma de detección de microplacas (Tabla de materiales) e inicie la medición inmediatamente. Utilice la configuración para la adquisición de placas de 96 pocillos.
   5. Capture las señales de electroquimioluminiscencia mediante una cámara CCD incorporada en un sistema de detección de electroquimioluminiscencia (Tabla de Materiales) y registre los recuentos de señales, que corresponden a unidades de luz relativas (RLU) y son directamente proporcionales a la intensidad de la luz.
      nota: Tras la estimulación electroquímica, la etiqueta de rutenio unida al electrodo de carbono emite luz de luminiscencia a 620 nm. Analice los datos con el software acompañado de instrumentos (Tabla de Materiales).

Tabla 1: Serie estándar de 0 a 1.800 ng/mL.