Reacción en cadena de la polimerasa en gotas digitales para la detección de mutaciones de Indel en genes diana

Resumen

Fuente: Carballar-Lejarazú, R., et al. PCR digital en gotas para detectar mutaciones de Indels en poblaciones de mosquitos anofelinos modificados genéticamente. J. Vis. Exp. (2021).

Este video demuestra el papel de la reacción en cadena de la polimerasa por gota digital en la identificación de la mutación indel en una muestra de ADN. La alta precisión y sensibilidad de la ddPCR permite una detección precisa y consistente de mutaciones raras presentes en una muestra, incluso a niveles bajos. Puede identificar y cuantificar mutaciones de indel en diferentes regiones del genoma, proporcionando información valiosa sobre los mecanismos de mutación y las consecuencias funcionales de estas mutaciones.

Protocolo

1. Reacciones de ddPCR y preparación para la generación de gotas

1. Cuantifique el ADN usando un fluorómetro.
   nota: Para el ensayo de caída, se recomienda utilizar un rango de 3.000-30.000 copias del genoma haploide por reacción, que está diseñado para detectar eventos NHEJ con una sonda de etiquetado HEX que se une a una secuencia WT del sitio de corte objetivo y no se recocará (caída) si hay una deleción o inserción en el sitio objetivo. lo que indica la presencia de una variante NHEJ.
2. Calcule el número de copias utilizando el peso del genoma haploide y la concentración de ADN en el extracto. Esto se hace multiplicando la concentración del ADN extraído por el volumen utilizado para obtener la masa total de ADN, y luego dividiéndolo por el peso del genoma haploide. Asegúrese de que el volumen añadido esté entre 1 y 10 μL. Diluya según sea necesario para estar en el rango recomendado de copias del genoma haploide.
   nota: Se estima que el genoma haploide de un Anopheles gambiae es de 0,27 pg por mosquito adulto.
3. Diseño de cebadores y sondas. Diseñe cebadores de oligonucleótidos directos e inversos con una temperatura de fusión del cebador (Tm) en el rango de 55-60 °C que flanqueen los extremos 5' y 3' del sitio objetivo del ARNg produciendo un amplicón de 150-400 pb.
   1. Sonda marcada con HEX (hexaclorofluoresceína) para la detección de NHEJ: Diseñe un oligonucleótido de ~15-20 pb de longitud complementaria al sitio objetivo y agregue la sonda HEX al extremo 5' y BHQ1 (BLack Hole Quencher 1) al extremo 3'. La Tm de la sonda de hidrólisis debe ser 3-10 °C más alta que la Tm de los cebadores.
   2. Sonda marcada con FAM (6-carboxifluoresceína) para referencia WT: Diseñe un oligonucleótido de ~15-20 pb de longitud complementario a un sitio de genoma conservado distante (alrededor de 25 pb) del sitio objetivo y agregue la sonda FAM al extremo 5' y BHQ1 al extremo 3'. La Tm de la sonda de hidrólisis debe ser 3-10 °C más alta que la Tm de los cebadores.

2. Preparación de la reacción PCR

1. Prepare 25 μL de la mezcla de muestras ddPCR con los siguientes componentes: ddPCR supermix para sondas (sin UTP): 12,5 μL, cebadores directos e inversos (10 μM): 1 μL cada uno, sondas HEX/FAM (10 μM): 0,625 μL cada una, ADN: 1-5 μL (3.750-37.500 copias del genoma haploide) y agua: hasta 25 μL.
2. Mezcle bien las reacciones mediante pipeteo por vórtice o reflujo (arriba y abajo) (20x).
   nota: Si las reacciones están en una placa de 96 pocillos, pipetea todo el volumen hacia arriba y hacia abajo 20 veces en lugar de vórtice para evitar la formación de burbujas.
3. Centrifugar brevemente las muestras para sedimentar la mezcla en el fondo del tubo o pozo.
   nota: Asegúrese de que las reacciones estén a temperatura ambiente para la generación de gotas. Prepare 1x de mezcla de ddPCR para pocillos extras/no utilizados en cada cartucho (cada cartucho tiene 8 pocillos).

3. Generación de gotas

1. Con una pipeta multicanal de 50 μL, cargue 20 μL de la mezcla de muestra de ddPCR en la fila central del cartucho (Figura 1A, arriba).
2. Cargue 70 μL de aceite en la fila inferior. Cargue 20 μL de 1x ddPCR supermix en pocillos no utilizados.
   nota: No introduzcas burbujas.
3. Coloque la junta tocando solo los bordes, evitando el área cóncava central (Figura 1B).
4. Coloque la placa de forma segura en el generador de gotas y cierre la tapa para iniciar la carrera.
5. Con la pipeta multicanal, transfiera 40 μL de la mezcla de emersión desde la fila superior del cartucho (Figura 1A, abajo) a la placa de 96 pocillos.
   1. Extraiga la muestra líquida durante 3-5 s en un ángulo de 45-30°. Expulse la mezcla lentamente durante más de 3 s en un ángulo de 45° en el costado del pozo, permitiendo que gotee por el costado. No pasa nada por la segunda parada (expulsión completa) de la pipeta para expulsar todo el líquido.
6. Con sellos térmicos de aluminio, selle las placas durante 5 s a 180 °C.

4. PCR

1. Coloque la placa sellada en el termociclador (Figura 1C) y establezca las condiciones de PCR recomendadas si sigue las pautas de entrega de NHEJ de la siguiente manera:
   1. Desnaturalización inicial a 95 °C durante 10 min.
   2. Establezca 40 ciclos de 94 °C durante 30 s para desnaturalizar, 55 °C durante 1 min para recocer y 60 °C durante 2 min para extenderse.
   3. Mantener a 98 °C durante 10 min.
   4. Mantener a 4 °C.
      nota: La temperatura de recocido para cebadores y juegos de sondas específicos se puede optimizar utilizando un gradiente térmico. Utilice una velocidad de rampa de 2 °C/s para todos los pasos. Las condiciones de PCR deben ajustarse en función de cada diseño y configuración experimental.

5. Lectura de gotas

1. Coloque la placa de forma segura en el lector de gotas con el pocillo A-1 en la parte superior izquierda (esquina alisada, las otras tres están bordeadas) (Figura 1D).
2. Configurar la placa en el programa: Designando FAM como el canal de referencia conocido y HEX como el desconocido (Figura 2A).
3. Ejecute el experimento de lectura de gotas como cuantificación directa. Una vez finalizada la ejecución, cambie el Tipo de experimento a Abandono (DOF) para el análisis (Figura 2A).

Resultados

Figura 1: Configuración y procedimiento experimental. (A) Preparación del cartucho para la generación de gotas. (Arriba) Las muestras se llenan en la fila central del cartucho, mientras que el aceite se llena en la fila inferior. (Abajo) Fila superior llena de gotas emulsionadas después de la generación de gotas. (B) Generador de gotas con un cartucho lleno de muestr...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivos
ddPCR Super Mix para sondas (sin dUTP)	Bio-Rad	1863024
EDTA (pH 8.0)	Invitrogen	AM9260G
Agua de grado PCR			Se puede utilizar cualquier agua certificada de grado PCR
Proteinasa K 20 mg/mL	Thermo Fisher Scientific	AM2546
materiales
Placa ddPCR de 96 pocillos	Bio-Rad	12001925
Generador de gotas DG8 cartucho y juntas	Bio-Rad	1864007
Aceite de generación de gotas para sondas	Bio-Rad	1863005
Sondas fluorescentes (p. ej., sondas FAM/HEX)	Sigma-Aldrich	N/A	Las sondas son específicas para cada experimento y se pueden comprar a cualquier vendedor certificado disponible.
Cebadores de oligonucleótidos directos e inversos	Sigma-Aldrich	N/A	Los cebadores son específicos para experimentos y se pueden comprar en cualquier vendedor certificado disponible.
equipo
Termociclador táctil C1000	Bio-Rad	1851148	Puede usar otro termociclador con función de gradiente y pozo profundo