Reacción en cadena de la polimerasa en gradiente para determinar la temperatura óptima de recocido

Resumen

Fuente: Tsujimoto, H. et al., Indel Detection following CRISPR/Cas9 Mutagenesis using High-resolution Melt Analysis in the Mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. (2021).

Este video muestra la reacción en cadena de la polimerasa en gradiente para la optimización de la temperatura de recocido de los cebadores, que establece la temperatura de recocido en gradiente a lo largo de los pocillos. El efecto de las diferentes temperaturas de recocido está determinado por el rendimiento de los productos amplificados que ayuda a optimizar la condición de reacción.

Protocolo

1. Escaneo de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs), diseño de cebadores HRMA y validación de cebadores

1. Identificación de SNP en colonias de mosquitos silvestres de laboratorio
   1. Seleccione el exón objetivo para interrumpir la traducción adecuada del polipéptido.
      nota: El objetivo debe estar cerca del codón de inicio o entre los residuos clave necesarios para la función de la proteína. Cuanto más corto es el exón (por ejemplo, ≤200 bases), más difícil es seleccionarlo y analizarlo. Evite editar cerca de los límites de un exón, ya que esto obliga a uno de los cebadores HRMA a cruzar un intrón o estar en un intrón. Esto no es deseable porque las tasas de SNP tienden a ser mucho mayores en esas regiones.
   2. Diseño de imprimación
      1. Vaya al sitio web de NCBI Blast - Primer Blast, copie y pegue el exón elegido en el cuadro de la parte superior de la página | elija el tamaño del producto PCR (asegúrese de que abarque la mayor parte del exón) | elija el organismo.
      2. Haga clic en Parámetros avanzados | Opte (para PCR Product Tm) y agregue 60 (para una temperatura óptima de 60 °C) | Consigue cartillas. Mantenga los demás parámetros como predeterminados.
   3. Obtener ADN genómico (ADNg) de la colonia de laboratorio de tipo salvaje. Aparta 10 mosquitos, anestesia con CO₂ y colócalos en una placa de Petri con hielo para mantenerlos inactivos. Coloque 10 tubos que contengan 0,5 μL del reactivo para la liberación de ADN del tejido y 20 μL de tampón de dilución, ambos proporcionados en el kit de liberación de ADN sugerido en la Tabla de Materiales.
   4. Retire una pata de un solo mosquito con pinzas y colóquela en el tubo correspondiente de una solución diluida del reactivo de liberación de ADN (del paso 1.1.3), sumergiendo completamente la pata en la solución. Repita este paso con los mosquitos restantes, limpiando las pinzas con etanol al 70% antes de pasar al siguiente.
   5. Incubar la solución que contiene la pierna a temperatura ambiente durante 2-5 min, luego a 98 °C durante 2 min, y dejar que se enfríe mientras se prepara la reacción de PCR.
      nota: Las placas que contienen el ADNg liberado se pueden almacenar a -20 °C, y el protocolo se puede pausar en este punto.
   6. Prepare 10 tubos que contengan 10 μL de 2x PCR Master Mix, cebadores a una concentración final de 0,5 μM y agua de grado molecular a un volumen final de 20 μL, y transfiera 1 μL de la muestra diluida a cada tubo. Realice PCR siguiendo estos parámetros de ciclo: 98 °C 5 min, 40 ciclos de 98 °C durante 5 s, 60 °C 30 s, 72 °C 20 s por kb; extensión final de 72 °C durante 1 min.
   7. Purifique los productos de PCR con una enzima para degradar los cebadores de PCR residuales y desfosforilar el exceso de dNTP o cualquier kit de limpieza de columnas. Proceda con la secuenciación de las muestras.
   8. Analice cada electroferograma para detectar la presencia de picos dobles/bases ambiguas, y ajuste las llamadas de base manualmente en cada secuencia utilizando el código base degenerado apropiado.
      nota: Este paso debe realizarse antes de la alineación de secuencias múltiples, ya que es común que el software de llamada base seleccione el pico más prominente como la llamada base "verdadera", dando la falsa impresión de una ausencia de SNP.
   9. Realice una alineación de secuencia múltiple utilizando el software de alineación, SeqMan Pro, que figura en la Tabla de Materiales u otro software de alineación de código abierto, como ClustalW o T-Coffe.
      1. Abra el software de alineación | haga clic en Agregar secuencias | seleccione las secuencias deseadas y haga clic en Agregar | Una vez elegidas todas las secuencias, haga clic en Listo.
      2. Haga clic en Ensamblar para realizar la alineación. Para abrir la alineación, haga clic en Contig 1 y analice la alineación e identifique los SNP (Figura 1).
         nota: Como alternativa a los pasos 1.1.3-1.1.6, la PCR se puede realizar a partir de ADN genómico aislado obtenido de muestras a granel (derivadas de >10 individuos). Los amplicones secuenciados se pueden analizar directamente para detectar la presencia de SNP que aparecen como picos dobles en el electroferograma, aunque los SNP raros serán más difíciles de detectar.
   10. Diseñar de 3 a 5 ARN guía simple (sgRNAs), evitando las regiones que contengan cualquier SNP identificado anteriormente, siguiendo el protocolo descrito en.

2. Diseño de imprimación HRMA

1. Pruebe la secuencia de exones para detectar la posible formación de estructuras secundarias durante la PCR utilizando mFold.
   1. Vaya al Servidor Web UNAFold | haga clic en mFold | en el menú desplegable, haga clic en Aplicaciones | Forma de plegamiento del ADN.
   2. Introduzca el nombre de la secuencia en el cuadro y pegue el exón.
   3. Cambie la temperatura de plegado a 60 °C; en las condiciones iónicas, cambie [Mg⁺⁺] a 1,5, y en las unidades cambie a mM; haga clic en Fold DNA.
   4. En Salida, debajo de Estructura 1, haga clic en pdf para abrir los Gráficos de Estructura Circular.
2. Vaya a NCBI Blast - Primer Blast para el diseño de imprimación.
3. Copie y pegue la secuencia de exones seleccionada determinada por secuenciación en el paso 1.1 (la secuencia que contiene el número más bajo de SNP o ningún SNP) en el cuadro de la parte superior de la página.
4. Utilice el símbolo < > para marcar y excluir secuencias que contienen SNP, el sitio de destino y las regiones con posible formación de estructura secundaria.
5. Seleccione el tamaño del producto PCR entre 80 y 150 pb y elija el organismo.
   nota: Se pueden utilizar con éxito tamaños de fragmentos más grandes (~300 pb). Sin embargo, los amplicones más largos pueden disminuir la sensibilidad entre secuencias que difieren en uno o solo unos pocos pares de bases.
6. Haga clic en Obtener imprimaciones. Seleccione 2 o 3 pares de cebadores para probar (idealmente, los sitios de cebadores están a una distancia de ≥20 a 50 pb de cualquier sitio objetivo de CRISPR).

3. Validación de cebadores

1. Realice una PCR de gradiente utilizando ADNg de un solo individuo.
   1. Prepare una mezcla maestra y retire una muestra para el control no molde (NTC) en un tubo separado. Agregue la plantilla a la mezcla maestra restante y alícuota en una placa de 96 pocillos.
   2. Siga los parámetros de ciclo: 98 °C 30 s, 34 ciclos de 98 °C durante 10 s, 55–65 °C 30 s, 72 °C 15 s; extensión final de 72 °C durante 10 min.
   3. Genere perfiles de fusión térmica siguiendo los parámetros: paso de desnaturalización 95 °C durante 1 min, recocido 60 °C durante 1 min, detección de la curva de fusión entre 75 °C y 95 °C en incrementos de 0,2 °C, con un tiempo de retención de 10 s a cada temperatura
      nota: Solo se deben utilizar temperaturas de recocido con un solo perfil de fusión térmica.

Resultados

Figura 1: Identificación de SNP. Representación esquemática de la alineación de secuencias múltiples del fragmento AaeZIP11 del tipo salvaje. En rojo están los SNPs, y en verde están los fragmentos libres de SNPs; esta región libre de SNP se sugiere para el diseño de sgRNA y cebadores. Abreviaturas: SNP = polimorfismo de un solo nucleótido; sgRNA = ARN guía simple; LVP = Cep...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
70% Etanol			Solución de etanol al 70% en agua
PCR de 96 pocillos y placas de PCR en tiempo real	VWR	82006-636	Para la obtención de ADN genómico (de la pata del mosquito)
Plantillas de placas de 96 pocillos			Impreso en casa, para el registro del genotipo
Bio Rad CFX96	Bio Rad		Máquina de PCR con capacidades de gradiente y HRMA
Depósitos diversificados de reactivos biotecnológicos	VWR	490006-896
Kit de limpieza rápida de PCR Exo-CIP	Biolaboratorios de Nueva Inglaterra	E1050S
Placa de Petri de vidrio	VWR	89001-246	150 mm x 20 mm
Cinta de sellado de acrilato de poliolefina Nunc, Thermo Scientific	VWR	37000-548	Para usar con las placas de PCR de 96 pocillos para obtener ADN genómico
Kit de PCR directa de tejido animal Phire (sin herramientas de muestreo)	Termo Fisher	F140WH	Para la obtención de ADN genómico y la realización de PCR
Software de análisis de fusión de precisión	Bio Rad	1845025	Se utiliza para el genotipado de las muestras de ADN de mosquitos y el análisis de las propiedades de desnaturalización térmica del ADN bicatenario (consulte el paso 3.3 del protocolo)
Pipeta monocanal	Gilson
Kit de PCR directa de tejido animal Phire (sin herramientas de muestreo)	Termo Fisher	F140WH	Para la obtención de ADN genómico y la realización de PCR
SeqMan Pro	Software DNAstar Lasergene		Para la alineación de secuencias múltiples
Pipeta monocanal	Gilson