PCR digital dúplex para la cuantificación simultánea de marcadores genéticos duales

Abstract

Fuente: Cao, Y., et al. A Ensayo de PCR digital dúplex para la cuantificación simultánea de Enterococcus spp. y el marcador HF183 asociado a las heces humanas en las aguas. J. Vis. Exp. (2016)

En este video, demostramos la técnica de PCR digital dúplex (ddPCR), una modificación de la técnica de PCR tradicional que es útil para detectar dos marcadores genéticos diferentes simultáneamente. Una sola reacción de PCR se divide en gotas emulsionadas del tamaño de un nanolitro que se amplifican de forma independiente, y la detección de señales de amplificación de fluorescencia de diferentes colores a partir de la fracción de gotas se utiliza para calcular la concentración inicial de las secuencias objetivo.

Protocol

1. Preparación de la mezcla de ensayo

1. Realice concentraciones de stock de 100 μmol/L para todos los cebadores en agua de grado molecular y sondas en tampón TE pH 8 [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ; HF183-1, BthetR1, BthetP].
   NOTA: Las sondas para los dos objetivos están marcadas con fluorescencia con diferentes fluoróforos como se indica en la Lista de Materiales/Equipos.
2. Prepare la mezcla maestra mezclando, según la reacción planificada, 12 μl de mezcla de PCR digital (2 veces el stock, consulte la Lista de materiales/equipos), 0,216 μl de cebador directo e inverso, 0,06 μl de cada sonda fluorescente y 5,016 μl de agua libre de nucleasas (concentración final: 900 nM cada cebador, 250 nM cada sonda). Pipetea hacia arriba y hacia abajo al menos 10 veces para mezclar teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire en la solución.
3. Pipetear 18 μl de mezcla maestra (del paso 1.2) en un tubo o placa de PCR normal, mezclando 6 μl de plantilla de ADN (extraído como se ha descrito anteriormente) para hacer una mezcla de ensayo para la generación de gotas. Si se procesan muestras por duplicado, pipetee 36 μl de mezcla maestra y 12 μl de plantilla de ADN en cada pocillo. Deje vacíos en la placa los pozos replicados correspondientes. Incluya controles positivos (consulte la Lista de Materiales/Equipos) y sin controles de plantilla (NTC) (es decir, con agua de grado molecular utilizada como plantilla)
   nota: El control positivo es necesario para garantizar que el ensayo funcione correctamente y el NTC es necesario para garantizar que no haya contaminación dentro de la placa y para establecer la línea de base fluorescente más adelante en el análisis de datos. Se recomienda a los usuarios primerizos que utilicen muestras de ADN sin diluir y diluidas.

2. Generación de gotas y configuración de placas PCR

1. Mezcle las mezclas de ensayo pipeteando hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 15 veces con una pipeta multicanal. Asegúrese de que la punta de la pipeta permanezca dentro del líquido para evitar que se formen burbujas excesivas dentro de la mezcla.
2. Inserte el cartucho 1 (que contiene 8 pocillos) en un soporte de cartucho blanco y cierre el soporte del cartucho. El cartucho 1 ahora está firmemente en su lugar y no se puede desprender del soporte mientras genera gotas. Con una pipeta multicanal, transfiera suavemente 20 μl de la mezcla de ensayo a la posición central del cartucho marcado como "Muestra" sin introducir burbujas de aire.
3. Pipetear 70 μl de aceite de generación de gotas en el lado izquierdo del cartucho (marcado como 'Aceite').
4. Cubra el cartucho con una junta, asegurándose de que la junta esté plana y sujeta uniformemente por las 4 marcas hacia el borde del cartucho. Presione el botón de luz verde en el generador de gotas para abrir y colocar el cartucho. Presione el botón de luz verde nuevamente para cerrar el generador.
   nota: Una vez que la puerta se cierra, el botón se atenúa, la puerta no se puede volver a abrir y la generación de gotas comienza inmediatamente y continúa durante aproximadamente 1 minuto.
5. Si realiza más de 8 reacciones, coloque el cartucho 2 en un segundo soporte de cartucho blanco y prepárelo de la misma manera que el cartucho 1 mientras la generación de gotas está en curso para ahorrar tiempo total de configuración.
6. Abra la puerta del generador de gotas cuando el botón de luz tenue se vuelva verde, lo que indica que se ha completado la generación de gotas. Retire el soporte blanco del cartucho que contiene el cartucho 1, déjelo a un lado y coloque el cartucho 2 en el generador de gotas.
7. Retire la junta del cartucho 1 y deséchela. Transfiera suavemente el volumen total (aproximadamente 40 μl) de las gotas generadas desde la tercera columna del cartucho (marcada como 'Droplets') a una placa de PCR final (mantenida a temperatura ambiente) para el ciclo térmico.
   nota: No deshaga el clic del soporte del cartucho blanco, ya que la acción puede romper las gotas recién generadas; Abra el soporte del cartucho solo después de que las gotas se hayan transferido a la placa final.
8. Repita los pasos 2.1 a 2.7 para obtener muestras adicionales.
9. Cuando todas las gotas estén en la placa de PCR final, coloque una cubierta de papel de aluminio perforable encima de la placa y colóquela en un sellador de placas. Ajuste el sellador a 180 °C, presione 'Play' en el sellador y deje sellar durante 10 segundos.

3. Ciclos térmicos y lectura de gotas

1. Coloque la placa sellada en el termociclador, una placa compatible con la placa PCR final utilizada en el paso 2.7, y una velocidad de aumento de temperatura de 2,0 °C/seg.
2. Ejecute el programa térmico de la siguiente manera: 10 min a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 seg a 94 °C y 60 seg a 60 °C, seguidos de una retención de 10 min a 98 °C (opcional: retención final a 4 o 15 °C).
3. Una vez finalizado el ciclo, transfiera la placa a un lector de gotas para la medición automática de la fluorescencia en cada gota en cada pocillo. Alternativamente, almacene la placa a 4 °C hasta 3 días antes de la lectura de las gotas. Asegúrese de que las gotas estén a temperatura ambiente antes de continuar con la lectura.
   1. Abra el software adjunto para configurar la lectura de gotas. En el menú predeterminado 'Configuración' que contiene un esquema de una placa vacía de 96 pocillos, haga doble clic en el pocillo A1 para abrir el menú que contiene tres secciones: 'Muestra', 'Ensayo 1' y 'Ensayo 2'.
   2. En la sección 'Muestra', escriba el ID de la muestra en el cuadro con la etiqueta 'Nombre' y presione enter o marque la casilla a la derecha marcada como 'Aplicar'. A continuación, haga clic en el menú desplegable con la etiqueta 'Experimento' y elija 'ROJO' (detección de eventos raros), y haga clic en enter.
   3. Desplácese a la sección denominada "Ensayo 1". En la sección "Nombre", rellene el ensayo (por ejemplo, Enterococcus) y haga clic en Intro. En el cuadro de abajo con la etiqueta 'Tipo', haga clic en el menú desplegable y elija 'Canal 1 Desconocido' y haga clic en Enter.
   4. Desplácese a la sección denominada "Ensayo 2". En la sección "Nombre", rellene el ensayo (por ejemplo, HF183) y haga clic en Intro. En el cuadro de abajo con la etiqueta 'Tipo', haga clic en el menú desplegable y elija 'Canal 2 desconocido' y haga clic en enter. Toda la información de los pasos 3.3.2 a 3.3.4 está ahora presente en el pozo A1.
   5. Asigne un nombre a todos los pozos subsiguientes que contengan gotitas. Para ahorrar tiempo total de configuración, haga clic en 'Shift' o 'Ctrl' para elegir varios pozos simultáneamente.
   6. Cuando la representación digital de la placa refleje la placa física, presione 'OK' en la parte inferior derecha del menú. En el nuevo menú que aparece en la parte superior del esquema de la placa, en la sección 'Plantilla', elija 'Guardar como' y asigne un nombre y guarde la placa.
   7. A la izquierda de la pantalla, haga clic en 'Ejecutar' y seleccione el conjunto de tintes apropiado en la ventana emergente "Opciones de ejecución". La recopilación de datos se inicia y se muestra en tiempo real en el software.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microtubos de baja ligereza	Coprotagonista	3207	Para el almacenamiento de reactivos, muestras/producción de mezclas maestras
Agua libre de nucleasas	FisherSci	BP2484-50
Tampón TE pH 8	FisherSci	BP2473-100
Placa rígida de 96 pocillos	BioRad	HSP-9601	Para la mezcla maestra inicial y la inoculación de muestras
Película de sellado de aluminio	BioRad	359-0133	Para sellar la placa de muestra
Generador de gotas	BioRad	186-3002
Aceite de generación de gotas	BioRad	186-3005
cartucho	BioRad	186-4008
Soporte de cartucho DG8	BioRad	186-3051
junta	BioRad	186-3009
Puntas de pipeta de 20 uL	Lluvia	GP-L10F	Para tansferring de muestra/mezcla maestra a cartucho
Puntas de pipeta de 200 uL	Lluvia	GP-L200F	Para transferir las gotas a la placa Twin.Tec final
Placa Twin.Tec de 96 pocillos	Eppendorf	951020320	Para el ciclo térmico y la lectura de las gotas finales
Lámina de sellado térmico perforable	BioRad	181-4040	Para sellar la placa Twin.Tec antes del ciclo térmico
Sellador de placas PX1 PCR	BioRad	181-4000	Solo se necesita el termociclador, sin óptica
Termociclador CFX96	BioRad	CFX96 y C1000
Lector de gotas QX100	BioRad	186-3001
Aceite para lector de gotas	BioRad	186-3004
Supermix de PCR por gotas	BioRad	186-3024	es decir, la mezcla de PCR digital en el manuscrito
Software QuantaSoft (v1.3.2)	Quantasoft	QX100	Para visualizar, analizar y exportar datos de ddPCR
Entero Imprimación Forward (Ent F1A)	operón	GAGAAATTCCAAACGAACTTG	Se puede utilizar un proveedor alternativo
Entero Imprimación inversa (Ent R1)	operón	CAGTGCTACCTCCATCATT	Se puede utilizar un proveedor alternativo
Sonda Entero (GPL813TQ)	operón	[6-FAM]-TGG TTC TCT CCG ETIQUETA AAA CTT ETIQUETA GGC TA-[BHQ1]	Se puede utilizar un proveedor alternativo, pero el fluoróforo tiene que ser FAM
HF183 Imprimación delantera (HF183-1)	operón	ATCATGAGTTCACATGTCCG	Se puede utilizar un proveedor alternativo
HF183 Imprimación inversa (BthetR1)	operón	CGTAGGAGTTTGGACCGTGT	Se puede utilizar un proveedor alternativo
Sonda HF183 (BthetP1)	operón	[6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1]	Se puede utilizar un proveedor alternativo, pero el fluoróforo debe ser HEX (si se utiliza VIC, se debe elegir la compensación matricial adecuada).
Control positivo			Mezcla de ADN genómico de E.faecalis y plásmido estándar HF183 (pedido de IDT). Para conocer los métodos detallados de cultivo de E. faecalis y las secuencias del plásmido HF183 ordenado, véase Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Los estándares de ADN de Enterococcus disponibles comercialmente (ATCC 29212Q-FZ) también se pueden utilizar en el control positivo en lugar del ADN genómico de E. faecalis preparado en laboratorio.