1. Cuantificación de ARN mediante un espectrofotómetro de microvolumen
- Asegúrese de que la configuración del espectrofotómetro esté establecida en ARN.
- Utilice 1-2 μL de agua de grado molecular para inicializar la máquina y establecer una línea de base.
- Utilice 1-2 μL de cada muestra de ARN de prueba para evaluar la cantidad de ARN.
- Guarde las lecturas y el documento.
- Ajuste el ARN a 1 μg/μL, si es necesario.
nota: El ARN debe mantenerse en hielo (o en un bloque frío) en todo momento. Si el ARN se obtiene utilizando un método basado en columnas o perlas, el ARN suele ser inferior a 1 μg/μL. En esta situación, use el ARN puro.
2. Preparación de series de dilución de ARN para determinar la sensibilidad del punto final
- Realice una dilución en serie de 10 veces el ARN.
- Marque los tubos con la serie de dilución (por ejemplo, 10-1, 10-2, etc.) y los detalles del ARN.
- Agregue 45 μL de agua de grado molecular a cada tubo.
- Añadir 5 μL del ARN (previamente diluido a 1 μg/μL) y mezclar bien.
- Deseche la punta de pipeta en el desinfectante adecuado y sustitúyala por una punta nueva.
- Tome 5 μL del 10-1 y agréguelo al tubo 10-2 y mezcle bien.
- Repetir 2.1.3-2.1.5 con las diluciones restantes.
NOTA: El ARN debe mantenerse en hielo (o en un bloque frío) en todo momento.
3. Preparación de reacciones RT-PCR en tiempo real
- Utilizando una hoja de cálculo, planifique la disposición de la placa de acuerdo con el número de muestras de prueba y muestras de control, tanto para los ensayos de lyssavirus como para los de ß-actina.
nota: Si se van a analizar 4 muestras por duplicado con control positivo y negativo, esto equivale a 10 reacciones para ambos ensayos.
- En una "sala limpia" o área separada de la plantilla de ARN, limpie las superficies con un desinfectante adecuado antes de usar o prepare una estación de trabajo de PCR (si se usa). Para preparar la estación de trabajo, limpie la superficie del gabinete con un desinfectante adecuado y coloque los elementos necesarios en la estación de trabajo y cierre las puertas. Encienda la luz ultravioleta durante 10 minutos.
- Retire los regentes y los cebadores del congelador y descongele (los reactivos enumerados en la Tabla 1 y los cebadores en la Tabla 2).
NOTA: La mezcla de enzimas se almacena en glicerol, por lo que no requiere descongelación y debe mantenerse en hielo (o en un bloque frío) en todo momento. Todos los demás reactivos se pueden descongelar a temperatura ambiente.
- Una vez descongelados, mezcle los reactivos y centrifugue brevemente para recoger el líquido.
NOTA: No haga vórtices de la mezcla de enzimas, simplemente centrifuga brevemente.
- Prepare mezclas maestras separadas para lyssavirus y ß-actina. Para cada reacción, agregue 7,55 μL de agua de grado molecular, 10 μL de 2 mezclas de reacción verde Universal SYBR, 0,6 μL de cebador directo, 0,6 μL de cebador inverso, 0,25 μL de mezcla de enzimas iTaq RT.
- Utilice una hoja de cálculo para calcular los volúmenes correctos y evitar errores en el cálculo manual. Asegúrese de que se haya preparado suficiente mezcla maestra para compensar los errores de pipeteo. Por lo tanto, si se requieren 10 reacciones (ver NOTA en 3.1), prepare 12 reacciones
- Prepare la mezcla maestra en hielo (o en un bloque frío) y permanezca en hielo hasta que se coloque en la máquina en tiempo real.
- Mezcle las mezclas maestras preparadas, centrifugue brevemente y dispense 19 μL en los pocillos correspondientes de tubos de tiras o en una placa de 96 pocillos compatible con la máquina en tiempo real en uso><.
NOTA: Minimice la producción de burbujas en los pocillos durante el pipeteo.
- En una habitación separada, o en un armario UV preparado como se describe en el punto 3.2, añadir cuidadosamente 1 μL del ARN previamente ajustado a 1 μg/μL (véase el paso 1.5) por debajo de la superficie del pocillo de mezcla maestra apropiado y mezclar suavemente. Deseche la punta de la pipeta en el desinfectante directamente después de su uso (debajo de la superficie).
- Agregue los controles después de las muestras de prueba, con el control positivo agregado a continuación y el control sin plantilla (NTC – agua de grado molecular) agregado al final. La cantidad de ARN utilizada puede modificarse en función del tipo de muestra y de la extracción de ARN utilizada. La cantidad utilizada debe validarse para garantizar que la reacción esté optimizada.
- Selle la placa con tapas de tiras o sellador, teniendo cuidado de asegurarse de que todas las tapas estén firmemente cerradas y etiquetadas lo suficiente como para orientar las muestras. Etiquete el borde de los tubos de placa/tira.
- Gire las muestras con una centrífuga para recoger todo el líquido en el fondo de los pocillos.
- Transfiera la placa a la máquina de PCR en tiempo real, abra la puerta y colóquela en el soporte asegurando la correcta ubicación/orientación de las muestras de acuerdo con el diseño de la placa><.
NOTA: Si se utilizan tiras de tubos, asegúrese de que el soporte esté en su lugar.
- Abra el programa de la máquina de PCR en tiempo real y elija la opción para el experimento en tiempo real SYBR con curva de disociación. Programe la máquina de PCR en tiempo real utilizando las condiciones de ciclo térmico especificadas en la Tabla 3, incluidos los puntos de recopilación de datos.
- Seleccione SYBR como colorante fluorescente y seleccione desconocido como tipo de muestra e inserte un nombre en el cuadro de nombre de muestra correcto.
nota: Diferenciar entre las réplicas y también entre los pocillos de lyssavirus y ß-actina.
- Elija una ubicación de archivo para guardar los datos experimentales, asegúrese de que la lámpara se apague al final de la ejecución y, a continuación, inicie la ejecución.
NOTA: Como el primer paso es una etapa RT, no se recopilan datos durante este tiempo, por lo tanto, si la lámpara requiere un período de calentamiento, esto puede ocurrir durante la etapa RT. La máquina y el software en tiempo real mostrarán las curvas de amplificación en tiempo real, mientras que la curva de fusión se generará al final del ciclo.
