PCR cuantitativa con transcripción inversa en tiempo real para el diagnóstico de infecciones virales

Resumen

Fuente: Marston, D. A. et al. Pan-lyssavirus RT-PCR en tiempo real para el diagnóstico de la rabia. J. Vis. Exp. (2019).

Este video muestra un método cuantitativo para detectar infecciones virales utilizando PCR con transcripción inversa en tiempo real. El paso de transcripción inversa convierte el ARN en ADNc, que luego se amplifica a través de ciclos de PCR. La presencia de ARN viral en la muestra se confirma mediante el análisis de las curvas de amplificación y disociación del ADN obtenidas de la PCR.

Protocolo

1. Cuantificación de ARN mediante un espectrofotómetro de microvolumen

1. Asegúrese de que la configuración del espectrofotómetro esté establecida en ARN.
2. Utilice 1-2 μL de agua de grado molecular para inicializar la máquina y establecer una línea de base.
3. Utilice 1-2 μL de cada muestra de ARN de prueba para evaluar la cantidad de ARN.
4. Guarde las lecturas y el documento.
5. Ajuste el ARN a 1 μg/μL, si es necesario.
   nota: El ARN debe mantenerse en hielo (o en un bloque frío) en todo momento. Si el ARN se obtiene utilizando un método basado en columnas o perlas, el ARN suele ser inferior a 1 μg/μL. En....

Resultados

Tabla 1: Reactivos de mezcla maestra RT-PCR en tiempo real de Pan-lyssavirus.

Reactivo	μL/Reacción
Agua de grado molecular	7.55
2x Mezcla de reacción universal RT PCR	10
Imprimación hacia adelante [20 μM]	0.6
Cebador inver.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Puntas de pipeta Art Barrier (varios tamaños)	Termopescador	varios
centrífuga	Beckman	Allegra 21R	Se requiere un rotor capaz de contener placas de 96 pocillos. Paso 3.8.
Centrífuga (micro)	sigma
Pipetas finlandesas (para dispensar 0,5-1000 μL)	Termopescador	varios
Kit de RT-PCR de un solo paso iTaq Universal SYBR Green	Bio-Rad	172-5150	Se pueden utilizar kits equivalentes si están validados
MX3000P o MX3005P sistema de PCR en tiempo real	Estratogén	N/A	Se pueden utilizar máquinas equivalentes si se validan
Base de placa de reacción MicroAmp	Cualquier		Se utiliza para sujetar la tira de tubos y las placas de forma segura.
Tiras transparentes planas ópticamente transparentes (8)	ABgene	AB-0866
Cuadro de ajuste perfecto (si se usan tiras de tubo)	Estratogén	N/A	Específico para la máquina
Imprimaciones: para obtener detalles de la imprimación, consulte la Tabla 2.			Pedido a escala de 0,05 μmol Purificado por HPLC.
Placas Thermo-Fast de 96 pocillos, sin faldón	ABgene	AB-600
Tiras Thermo-Fast (8) Termotubos	ABgene	AB-0452
Máquina de vórtice / Whirlimixer	Equipamiento científico Fisons	SGP-202-010J
A menos que se indique lo contrario, se pueden utilizar equipos alternativos