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1. Extracción de ADN a partir de tejido FFPE, sangre periférica y aspirado de médula ósea
- Para tejido FFPE de médula ósea con kit de extracción de ADN FFPE
- Comience con tejido FFPE de portaobjetos sin teñir (5 a 10 secciones con un grosor de 5 a 10 μm).
nota: Si comienza con virutas de tejido, use de 3 a 6 secciones de 5 a 10 μm de grosor y pase al paso 1.1.6.
- Coloque los portaobjetos en una canasta de portaobjetos y prepare cuatro depósitos de lavado (dos para xileno y dos para alcohol al 100%). Agregue un volumen mínimo de 600 mL de la solución a cada cesta.
- Desparafinar los portaobjetos haciendo un lavado de xileno de 5 min en la primera bandeja. Transfiera los portaobjetos al segundo depósito de lavado de xileno durante 5 minutos más.
- Después de la desparafinación, lave los portaobjetos con alcohol al 100% durante 5 min. Transfiera los portaobjetos al segundo depósito de lavado con alcohol durante 5 min.
- Deje que los portaobjetos se sequen completamente bajo una campana antes de rasparlos con una cuchilla de afeitar en un tubo de microcentrífuga.
nota: Si se dispone de un portaobjetos de H&E con la región tumoral indicada, alinee los portaobjetos y raspe solo la región tumoral.
- Proceda con las instrucciones del folleto del fabricante incluido en el kit.
- Para aspirado de BM y sangre periférica
- Extraiga de acuerdo con el folleto de instrucciones del fabricante con estas especificaciones.
nota: Existen numerosos kits y métodos disponibles en el mercado para la extracción de ADN a partir de tejidos y células FFPE. Prácticamente, todos pueden ser utilizados. Utilice un método establecido en el laboratorio.
- Utilice 200 μL de sangre periférica (PB) o 100 μL de BM + 100 μL de PBS.
- Utilice 4 μL de solución madre de ARNasa A.
- Elución con tampón de elución de 100 μL.
- Cuantificación de ADN
- Mida las concentraciones de ADN utilizando un espectrofotómetro que garantice una relación de 260 nm/280 nm de aproximadamente 1,8 (para ADN puro). Si la proporción es apreciablemente menor, puede indicar la presencia de proteínas, fenol u otros contaminantes que pueden interferir con las aplicaciones posteriores.
- Ajuste las concentraciones de ADN a aproximadamente 50 - 100 ng/μL con el tampón de elución adecuado.
2. PCR de bloqueo de tipo salvaje
- Diseño de imprimación
- Diseñar y obtener cebadores para genes de interés de acuerdo con las directrices generales de diseño de cebadores de PCR previamente descritas. Incluya cebadores de secuenciación universal M13 hacia adelante y hacia atrás en cebadores de PCR.
nota: El ensayo MYD88 fue desarrollado para amplificar el exón 5 de MYD88 (G259 - N291) y 110 nucleótidos ubicados en la región intrónica 5' para cubrir el sitio de empalme y parte del intrón 4. Los cebadores de avance y retroceso se diseñaron con una secuencia 5'-M13 (M13- adelante: tgt aaa acg acg gcc agt; M13-reverso: cag gaa aca gct atg acc) para permitir el recocido de cebadores de secuenciación complementarios (ver Tabla de Materiales).
- Diseño de oligonucleótidos de ácidos nucleicos bloqueados
- Diseñe el oligonucleótido de bloqueo para que tenga aproximadamente 10 a 15 bases de longitud y sea complementario a la plantilla WT donde se desea el enriquecimiento mutante.
nota: Un oligonucleótido más corto mejorará la discriminación de desajustes. Para lograr una alta especificidad del objetivo, es importante no utilizar demasiados nucleótidos de bloqueo, ya que esto puede dar lugar a un oligonucleótido muy "pegajoso". El contenido y la longitud y el nucleótido de bloqueo deben optimizarse de acuerdo con el nucleótido específico que se debe bloquear. Es importante lograr una alta especificidad de unión sin comprometer la estructura secundaria y correr el riesgo de autocomplementariedad.
- Diseñe el oligonucleótido de bloqueo para que tenga una Tm 10 - 15 °C por encima de la temperatura de extensión durante el termociclado. Ajuste la Tm añadiendo o eliminando bases bloqueadoras o sustituyendo el ADN por bases bloqueantes, evitando largos tramos (3 - 4 bases) de bases G o C bloqueantes.
- Vaya al sitio web de herramientas de Oligo (consulte la Tabla de materiales) y seleccione la herramienta "Predicción de bloqueo de Oligo Tm".
- Pegue la secuencia de la plantilla WT que desea bloquear en el cuadro "Secuencia de oligonucleótidos". Agregue "+" delante de las bases para indicar las bases de los bloqueadores.
- Seleccione el botón "Calcular" para determinar la Tm aproximada del híbrido DNA-Blocker.
- Diseñe el oligo de bloqueo para evitar la formación de estructuras secundarias o autodímeros.
- Navegue hasta el sitio web de herramientas de Oligo (consulte la Tabla de materiales) y seleccione la herramienta "Optimizador de Oligo de bloqueo".
- Pegue la secuencia de la plantilla WT que desea bloquear en el cuadro. Agregue "+" delante de las bases para indicar bases de bloqueo.
- Seleccione las dos casillas para "Estructura secundaria" y "Solo uno mismo". Presione el botón Analizar para revisar el oligonucleótido en busca de estructuras secundarias potencialmente problemáticas o autodímeros.
nota: Las puntuaciones representan estimaciones muy aproximadas de las Tm's de las estructuras secundarias y de los autodímeros. Por lo tanto, las puntuaciones más bajas son óptimas y se pueden lograr limitando el emparejamiento bloqueador-bloqueador. El oligonucleótido bloqueante para MYD88 [bloqueador de MYD88 (TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+C/invdT/)] fue diseñado para cubrir los aminoácidos Q262-I266 y presenta un dT invertido 3' para inhibir tanto las extensiones por la ADN polimerasa como la degradación por la 3'-exonucleasa. Este oligo de bloqueo específico es un 17 mer con 10 bases de bloqueo que se denotan como "+N". Las 7 bases restantes son nucleótidos de ADN ordinarios.
- Configuración de WTB-PCR y termociclado
- Prepare una mezcla maestra WT-PCR (MMX) utilizando 2,5 μL de tampón de reacción de PCR 10x con 20 mM de MgCl2, 250 μM de dNTPs, 0,2 μM de cebador directo e inverso, 1,2 μM de bloqueador MYD88 y H2O ultrapura de ADNasa, libre de ARNasa, para crear un volumen de solución final de 21,75 μL por reacción><.
nota: Las concentraciones de trabajo son para el volumen de reacción final de 25 μL (después de la adición de la molde de ADN y la polimerasa). La PCR MMX convencional se prepara simplemente omitiendo la adición de un bloqueador. Todos los pasos del protocolo siguen siendo idénticos tanto para la WTB como para la PCR convencional. Esto se puede utilizar para validar y determinar el enriquecimiento logrado mediante la adición de un bloqueador.
- Al calcular la cantidad de MMX que se debe preparar, asegúrese de tener en cuenta 3 reacciones adicionales (controles positivos y negativos y un control sin plantilla para verificar la contaminación) y al menos 1 reacción adicional para el error de pipeteo.
- Vortex MMX a fondo. El MMX puede almacenarse a -80 °C durante un año.
- Añadir 0,25 μL de ADN polimerasa Taq por reacción a la MMX e invertir para mezclar. Una vez que se haya agregado la polimerasa al MMX, manténgalo en hielo.
- Coloque una nueva placa de PCR de 96 pocillos en una placa fría y pipetee 22 μL de MMX con la polimerasa en cada pocillo de reacción.
- Añadir 3 μL de ADN genómico (50 - 100 ng/μL a cada uno de los pocillos que contienen la MMX con la polimerasa.
- Selle la placa y centrifugue brevemente para asegurarse de que la solución llegue al fondo de cada pocillo.
- Cargue la placa PCR en un termociclador.
- Ajuste las condiciones de termociclado para la reacción WTB-PCR de la siguiente manera: desnaturalización inicial a 95 °C durante 6 min; 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 30 s, recocido de imprimación a 56 °C durante 30 s y extensión a 72 °C durante 1 min 20 s; extensión final a 72 °C durante 10 min.
nota: La mejor práctica consiste en completar el resto del protocolo en un área físicamente separada para evitar la contaminación del amplicón en configuraciones futuras.