Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa para enumerar bacteriófagos

Resumen

Fuente: Peng, X., et al., PCR cuantitativa del bacteriófago T7 de Biopanning. J. Vis. Exp. (2018)

En este video, discutimos la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa, qPCR, para enumerar bacteriófagos T7 a través de la cuantificación de ADN. El colorante fluorescente de la mezcla de PCR se une a las hebras de ADN recién sintetizadas y emite fluorescencia, que se mide.

Protocolo

1. Preparar reacciones de qPCR

NOTA: Una reacción de PCR es para una muestra. Cada reacción de PCR contiene 5 μL de mezcla maestra de qPCR (ver materiales), 1 μL de 5 μM de mezcla de pares de cebadores, 2 μL de_H2O y 2 μL de muestra de fagos T7 tratada térmicamente. Para reacciones de PCR múltiples, todos los reactivos, excepto la muestra de fago, se mezclan previamente en un tubo de 1,5 ml. El volumen de cada reactivo en la premezcla depende del número de muestras de fagos para qPCR.

1. Prepare la premezcla de qPCR para 10 muestras de fagos biopanificados de concentración desconocida y 7 muestras de concentraciones estándar por triplicado. Como resultado, hay 51 muestras en total y, por lo tanto, 51 reacciones de qPCR (es decir, una reacción por muestra). Para 51 reacciones, prepare una premezcla de 255 μL de mezcla maestra de qPCR (51x 5 μL), 51 μL de cebadores (51x 1 μL) y 102 μL de H₂O (51x 2 μL).
   nota: Se recomienda preparar algunas reacciones de PCR adicionales para compensar la pérdida de volumen durante la alícuota de la mezcla de PCR en cada pocillo de la placa de qPCR de 96 pocillos.
2. Alícuota 8 μL de premezcla de PCR en cada pocillo de placa de qPCR de 96 pocillos para un total de 51 pocillos (es decir, 51 reacciones de qPCR). No es necesario cambiar las puntas durante la alícuota.
3. Agregue 2 μL de muestras de fagos T7 tratadas térmicamente o ADN de referencia de fagos T7 a cada pocillo (Figura 1B); cambie las puntas cuando agregue diferentes muestras de ADN al pocillo para evitar la contaminación cruzada. Además, dispense las muestras de ADN de 2 μL debajo de la superficie de la premezcla de qPCR (es decir, en la premezcla de PCR de 8 μL).
4. Selle la placa qPCR con una película adhesiva.
   nota: Este paso es crítico, independientemente del tipo de placa qPCR. Utilice el kit recomendado para sellar la placa por completo; de lo contrario, cualquier región no sellada de la placa causará pérdida de volumen durante el ciclo de PCR.
5. Envuelva la placa de qPCR con papel de aluminio para minimizar el fotoblanqueo de fluorescencia y proceda a ejecutarla en el equipo de qPCR.

2. condiciones de ciclo de qPCR

NOTA: Las condiciones de ciclo de qPCR se establecieron en el equipo de qPCR específico.

1. Ejecute la placa qPCR de 96 pocillos en el equipo de qPCR. En el equipo, seleccione la configuración en el menú para configurar las siguientes condiciones experimentales (Figura 1C).
2. Configure las condiciones de ciclo de la siguiente manera para un volumen de muestra de 10 μL: un ciclo a 50 °C durante 2 minutos, un ciclo a 95 °C durante 2 minutos, seguido de 40 ciclos de (95 °C durante 15 s, 60 °C durante 1 min). Después, ejecute los ajustes de la curva de fusión: un ciclo de 95 °C durante 15 s, 60 °C durante 1 min y 95 °C durante 15 s.
3. Proceda a analizar los datos.

Resultados

Figura 1: Tratamiento de muestras de fagos, preparación de la reacción de qPCR y ejecución de qPCR. Las muestras de fagos T7 pretratadas con DNasa I se calentaron a 100 °C durante 15 minutos para liberar el ADN T7 de las partículas intactas del fago (A); la mezcla de qPCR se preparó como se describe en el protocolo. Todos los preparativos se hicieron en hielo (A); Se...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Imprimadores para el ADN genómico T7	IDT (en inglés)		F: CCTCTTGGGAGGAAGAGATTTG R: TACGGGTCTCGTAGGACTTAAT
T7 Select ADN de control de envases	EMD Millipore	69679-1UG
Placa de reacción óptica MicroAmp de 96 pocillos	ThermoFisher Scientific	N8010560
Mezcla maestra qPCR-Potencia la mezcla maestra SYBR Green	Biosistemas aplicados	Biosistemas aplicados
Kit de película adhesiva óptica MicroAmp	ThermoFisher Scientific	ThermoFisher Scientific
H2O destilado sin DNasa / RNasa ultrapura	Invitrogen	10977015
Sistema de PCR en tiempo real ViiA7 con bloqueo rápido de 96 pocillos	ThermoFisher Scientific	4453535
Software de PCR en tiempo real QuantStudio	ThermoFisher Scientific		v1.2