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1. PCR asimétrica para amplificar el ssDNA
- Prepare una mezcla de reactivos de PCR asimétrica para amplificar el ssDNA que se va a analizar. Descongele los reactivos de la Tabla 1 en hielo. No mantenga la enzima polimerasa Taq (50 U/μL) en hielo, sino que guárdela a 20 °C hasta que la necesite.
- Agitar suavemente todos los reactivos y, a continuación, centrifugar brevemente los tubos a 10.000 x g durante 10 s.
- Combine todos los reactivos como se describe en la Tabla 1.
- Coloque las muestras en un termociclador e inicie la PCR asimétrica en las siguientes condiciones: 25 ciclos (95 °C durante 30 s, 52 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s), 85 °C durante 5 min, mantener a 4 °C.
2. Microsphere-PCR para amplificar el ssDNA
NOTA: Esta sección describe el protocolo para amplificar ssDNA en un tubo de reacción de PCR. Las reacciones de microesferas-PCR se realizaron en 50 μL de volumen de reacción. Las secuencias detalladas utilizadas para amplificar el ssDNA se enumeran en la Tabla 2. En este caso, el Ap en la superficie de las microesferas puede recocer a plantillas de ADN aleatorias de manera complementaria. Este es un paso muy importante para la producción de hebras de ADN complementarias (hebra de ADN antisentido, Figura 1). El ADN extendido se utiliza como molde para la amplificación de microesferas-PCR.
- Preparar la mezcla de reactivos de microesferas y PCR. Descongele los reactivos de la Tabla 3 en hielo; sin embargo, no mantenga la enzima polimerasa Taq en hielo. Guárdelo a -20 °C hasta que lo necesite.
- Agitar suavemente todos los reactivos y, a continuación, centrifugar brevemente los tubos a 10.000 x g durante 10 s.
- Obtenga aproximadamente ~ 25 microesferas a través del conteo microscópico.
nota: El número de microesferas en un tubo de reacción se calcula utilizando un microscopio óptico con un aumento de 40X. Se utilizan alrededor de ~ 25 microesferas para la amplificación de microesferas-PCR. Información más detallada se encuentra en el Paso 3.
- Combine todos los reactivos como se describe en la Tabla 3.
- Coloque las muestras en un termociclador e inicie la PCR asimétrica en las siguientes condiciones: 25 ciclos (95 °C durante 30 s, 52 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s), 85 °C durante 5 min, mantener a 4 °C.
- Después de la amplificación, agregue 8 μL de tampón de carga 6x y cargue 15 μL de cada muestra en gel de agarosa al 2%. A continuación, realice la electroforesis a 100 V durante 35 min en 1x tampón TAE (Tris-acetato-EDTA, 40 mM de Tris-acetato, 1 mM EDTA, pH 8,2).
Tabla 1. Mezcla de componentes de reactivos de PCR asimétricos en una reacción de 20 μL.
| Reactivo | Volumen para 1x reacción (μL) | Concentración final |
| Plantilla de ADN aleatorio | 1 | 1 ng/μL |
| Imprimación de etiquetado | 1 | 0,4 μM |
| Imprimación inversa | 1 | 0,02 μM |
| Búfer Taq 10X | 5 | 1X |
| 10 mM de dNTP | 4 | 2,5 mM |
| Ex taq (1000U) | 0.2 | 1 U |
| Agua | 37.8 | - |
| total | 50 | - |
Tabla 2. Información de secuencia para Microsphere-PCR.
| plantilla | secuencia | Longitud (nt) |
| Plantilla de ADN aleatorio | 5'- ATA CCA GCT TAT TCA ATT (Secuencia aleatoria, 40 mer) AGA TAG TAA GTG CAA TCT-3' | 76 |
| Imprimación Tag-Forward (Tag-F) | 5'- GGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG ATA CCA GCT TAT TCA ATT-3' | 42 |
| Imprimación inversa | 5'- AGA TTG CAC TTA CTA TCT-3' | 18 |
Tabla 3. Componentes de la mezcla de reactivos Microsphere-PCR en una reacción de 50 μL
| Reactivo | Volumen para 1x reacción (μL) | Concentración final |
| Ap-Microesferas | ~25 microesferas | - |
| Plantilla de ADN aleatorio | 1 | 1 ng/μL |
| Imprimación Tag-Forward | 1 | 0,4 μM |
| Búfer Taq 10X | 5 | 1X |
| 10 mM dNTP | 4 | 2,5 mM |
| Ex taq (1000U) | 0.2 | 1 U |
| Agua | 37.8 | - |
| total | 50 | - |
