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Artículo de método

PCR anidada para detectar una secuencia genómica viral específica

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8 de julio de 2025

En este artículo

Resumen

Fuente: Feng, Y., et al. Evaluación de una reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa anidada universal para la detección de Lyssavirus. J. Vis. Exp. (2019).

Este video describe la reacción en cadena de la polimerasa anidada, una técnica que consiste en dos procesos secuenciales de amplificación de PCR utilizando dos conjuntos de cebadores. El primer conjunto de cebadores está destinado a recocer secuencias aguas arriba del segundo conjunto, lo que resulta en la amplificación selectiva de secuencias de genes específicos. Esta PCR es más sensible y específica que una PCR normal y es muy utilizada como técnica de detección de diversas enfermedades.

Protocolo

1. Transcripción inversa del ARN viral

  1. Retire los reactivos RT enumerados en la Tabla 1 del congelador, manténgalos en hielo y descongélelos y vértice antes de usarlos.
  2. Prepare 12 μL de mezcla de reacción RT en un tubo de PCR de 0,2 mL con los reactivos enumerados en la Tabla 1. Permita variaciones en el pipeteo preparando un volumen de la mezcla maestra de al menos un tamaño de reacción mayor que el requerido.
  3. Agregue una muestra de 8 μL, ARN de control positivo o control negativo a la mezcla de reacción RT dentro de una estación de trabajo de PCR en una sala de plantillas. El control positivo RT es AR....

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Divulgaciones

No se han declarado conflictos de interés.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
ddH2Ovariosvarios
dNTPs (10 mM)Takara4019
dNTP (2,5 mM)Takara4030
Ex-Taq (5 U/μL)TakaraRR001
Tubos de microcentrífugavariosvarios
Transcriptasa inversa M-MLV (200 UI/μL)Takara2641A
Oligo (dT)15Takara3805
Máquina de PCRBIO-RADT100
Tubos de PCRvariosvarios
Pipettoresvariosvarios
Imprimación aleatoriaTakara3801
Inhibidor de la ARNasa (40 UI/μL)Takara2313A
Libre de RNasa ddH2OTakara9102
Búfer Taq (10x)Takara9152A
Consejosvariosvarios
Mezclador de vórticevariosvarios

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