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1. Transcripción inversa del ARN viral
- Retire los reactivos RT enumerados en la Tabla 1 del congelador, manténgalos en hielo y descongélelos y vértice antes de usarlos.
- Prepare 12 μL de mezcla de reacción RT en un tubo de PCR de 0,2 mL con los reactivos enumerados en la Tabla 1. Permita variaciones en el pipeteo preparando un volumen de la mezcla maestra de al menos un tamaño de reacción mayor que el requerido.
- Agregue una muestra de 8 μL, ARN de control positivo o control negativo a la mezcla de reacción RT dentro de una estación de trabajo de PCR en una sala de plantillas. El control positivo RT es ARN extraído del cultivo celular infectado con la cepa fija de RABV CVS-11 (virus de desafío estándar-11) y almacenado a -80 °C. El control negativo contiene ddH2O libre de RNasa.
- Mezcle el contenido de los tubos RT mediante vértices; luego, centrifugue brevemente.
- Cargue los tubos de reacción en un termociclador. Configure el programa de síntesis de ADNc con las siguientes condiciones: 42 °C durante 90 minutos, 95 °C durante 5 minutos y 4 °C en espera. Ajuste el volumen de reacción a 20 μL. Inicie la ejecución RT.
2. PCR de primera ronda
- Mantenga los reactivos de PCR enumerados en la Tabla 2 en hielo en una sala limpia hasta su uso; luego, descongélelos y vértelos.
- Prepare la mezcla de PCR de la primera ronda en un tubo de PCR de 0,2 ml con los reactivos enumerados en la Tabla 2.
- Añada una muestra de 2 μl de ADNc o plásmido a la mezcla de PCR de primera ronda dentro de una estación de trabajo de PCR en una sala de plantillas. El control positivo de PCR es ADNc CVS-11 preparado como se mencionó en el paso 1.3 para el método RT anterior. El control negativo de PCR es dd H2O.
- Transfiera los tubos sellados a un termociclador PCR y realice el ciclo utilizando los parámetros enumerados en la Tabla 3.
3. PCR de segunda ronda
- Prepare la mezcla de PCR de la segunda ronda en un tubo de PCR de 0,2 ml utilizando los reactivos enumerados en la Tabla 4.
- Añada 2 μL del producto de PCR de primera ronda a la mezcla de PCR de segunda ronda. Además, incluir dd H2O como control negativo de la PCR de segunda ronda.
- Realice el ciclo térmico de PCR utilizando los mismos parámetros que se indican en el paso 2.4.
Tabla 1: Reactivos de transcripción inversa para la síntesis de ADNc.
| componente | Volumen por reacción (μl) |
| dNTPs (2.5 mM ) | 4 |
| Cebador aleatorio (50 μM) | 1.5 |
| Oligo(dT) 15 (50 μM) | 0.5 |
| Búfer M-MLV (5x) | 4 |
| Transcriptasa inversa M-MLV (200 UI/μL) | 1 |
| RNasina (40 UI/μL) | 1 |
| Volumen total | 12 |
Tabla 2: Reactivos de la primera ronda de PCR.
| componente | Volumen por reacción (μl) |
| dNTPs (10 mM) | 1 |
| Ex-Taq (5 U/μL) | 0.3 |
| Búfer Taq (10x) | 5 |
| N127 (20 μM) | 1 |
| N829 (20 μM) | 1 |
| dd H2O | Artículo 39.7 |
| Volumen total | 48 |
Tabla 3: Parámetros cíclicos de la PCR de primera y segunda ronda
| temperatura | Hora | ciclo |
| 94 °C | 2 minutos | 1 |
| 94 °C | 30 s | 35 |
| 56 °C | 30 s | 35 |
| 72 °C | 40 s | 35 |
| 72 °C | 10 minutos | 1 |
| 4 °C | ∞ | |
Tabla 4: Reactivos de la segunda ronda de PCR.
| componente | Volumen por reacción (μl) |
| dNTPs (10 mM) | 1 |
| Ex-Taq (5 U/μL) | 0.3 |
| Búfer Taq (10x) | 5 |
| N371F (20 μM) | 1 |
| N371R (20 μM) | 1 |
| dd H2O | Artículo 39.7 |
| Volumen total | 48 |