PCR de fusión de alta resolución para determinar variaciones de secuencia en secuencias de ADN mutante

Resumen

Fuente: Kisserli, A., et al. PCR de fusión de alta resolución para el genotipado de polimorfismo de longitud del receptor 1 del complemento del complemento : una herramienta innovadora para la evaluación de la susceptibilidad génica de la enfermedad de Alzheimer. J. Vis. Exp. (2017).

En este video, describimos una técnica de PCR de fusión de alta resolución para determinar el polimorfismo de longitud de fragmentos de ADN de diferentes longitudes de secuencia, basada en el análisis de la temperatura de fusión.

Protocolo

1. Protocolo HRM-PCR

1. Descongela las muestras de ADN. Diluir las muestras de ADN en tubos de 1,5 mL con agua para ajustarlas a una concentración de 10 ng/μL
   nota: El volumen total de ADN diluido debe estar entre 2 μL y 10 μL.
2. Descongele las soluciones de imprimación. Diluir las soluciones de cebador en tubos de 1,5 ml con agua para ajustarlas a la misma concentración de 6 μM.
   nota: Las secuencias de cebadores y las condiciones de reacción se proporcionan en la Tabla 1.
3. Descongele las soluciones del kit HRM-PCR y mezcle cuidadosamente mediante vórtice para garantizar la recuperación de todo el contenido. Centrifugar brevemente los tres viales que contienen la mezcla enzimática con colorante de unión al ADN, MgCl₂, y agua en una microcentrífuga antes de abrirlos. Guárdelos a temperatura ambiente.
4. En un tubo de 1,5 ml a temperatura ambiente, prepare la mezcla de PCR para una reacción de 20 μl añadiendo los siguientes componentes en el orden que se indica a continuación:
   1. 10 μL de mezcla enzimática con colorante de unión al ADN;
   2. 2 μL de 25 mM MgCl₂;
   3. 1 μL de cebador 1, 6 μM (concentración final: 300 nM);
   4. 1 μL de cebador 2, 6 μM (concentración final: 300 nM); y
   5. 5 μL de agua.
      nota: Para preparar la mezcla de PCR para más de una reacción, multiplique los volúmenes anteriores por el número de reacciones que se van a ejecutar, más una reacción adicional.
5. Mezclar con cuidado por vórtice.
6. Pipetear 19 μL de mezcla de PCR, preparada anteriormente, en cada pocillo de una placa blanca de pocillos múltiples.
7. Añadir 1 μL de plantilla de ADN ajustada a la concentración.
   nota: Para las reacciones de control, ejecute siempre un control negativo con las muestras. Para preparar un control negativo, reemplace el ADN molde con agua.
8. Selle la placa blanca de pocillos múltiples con papel de sellado.
9. Coloque la placa blanca de pocillos múltiples en la centrífuga y equilibrela con un contrapeso adecuado (es decir, otra placa de pocillos múltiples). Centrífuga durante 1 min a 1.500 x g en una centrífuga de cangilón basculante estándar que contiene un rotor para placas multipocillo con adaptadores adecuados.
10. Cargue la placa blanca de pocillos múltiples en el instrumento HRM-PCR.
11. Inicie el programa HRM-PCR con las siguientes condiciones de PCR:
    Desnaturalización: 95 °C durante 10 min; 1 ciclo.
    Amplificación: 95 °C durante 10 s, 62 °C durante 15 s y 72 °C durante 20 s; 47 ciclos.
    Curva de fusión: 95 °C; velocidad de rampa: 0,02 °C/s; 25 adquisiciones por °C; 1 ciclo.
    Refrigeración: 40 °C durante 30 s; velocidad de rampa 2,2 °C/s; 1 ciclo.

Tabla 1: Imprimadores y parámetros utilizados en el análisis de fusión de alta resolución.

>2. Análisis de HRM para determinar el polimorfismo de longitud CR1

NOTA: La metodología descrita (Figura 1) es específica de nuestro software (Ver la Tabla de Materiales), aunque se pueden utilizar otros paquetes de software.

1. Abra un software de escaneo de genes para realizar el análisis de escaneo de polimorfismo de longitud CR1.
2. Abra el experimento que contiene el programa de amplificación y el programa de la curva de fusión.
3. Haga clic en Editor de muestras en la barra de módulos y, a continuación, seleccione el flujo de trabajo de escaneo.
4. Defina las propiedades de las muestras (es decir, nombre; control desconocido o negativo).
5. Haga clic en Análisis en la barra del módulo.
6. En la lista Crear nuevo análisis, seleccione Análisis de genes.
7. Haga clic en la pestaña Normalización para normalizar las curvas de fusión.
8. Haga clic en la pestaña Cambio de temperatura para restablecer el eje de temperatura (eje x) de las curvas de fusión.
   nota: El gráfico inferior muestra las curvas de fusión que están normalizadas y cambiadas por temperatura.
9. Haga clic en el botón Calcular para analizar los resultados y determinar la agrupación.
10. Haga clic en la pestaña Gráfico de diferencia en el área de gráficos para ver las Curvas de fusión normalizadas y desplazadas y la gráfica de diferencia normalizada y desplazada por temperatura.

Resultados

Figura 1: Capturas de pantalla de la interfaz gráfica del software utilizado en el paso 2 del protocolo. (A) Abra el software de escaneo de genes. (B) Programa de amplificación y programa de curva de fusión. (C) Haga clic en Editor de muestras en la barra de módulos. (d) Seleccione Escaneo. (E) Definir ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
bata			protección
Guantes de examen de nitrilo sin polvo SensiCareIce	Medline Industries, Inc., Mundelein, IL 60060, Estados Unidos	486802	Protección de muestras
Pipeta Eppendorf Reference 2, 0,5-10 μL	Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Francia	4920000024	Pipeteo de muestras
Pipeta Eppendorf Reference 2, 20-100 μL	Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Francia	4920000059	Pipeteo de muestras
Pipeta Eppendorf Reference 2, 100-1000μL	Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Francia	4920000083	Pipeteo de muestras
TipOne 10μL Graduado, punta de filtro	Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Alemania	S1121-3810	Pipeteo de muestras
TipOne 1-100μL biselado, punta de filtro	Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Alemania	S1120-1840	Pipeteo de muestras
ART 1000E Punta de barrera	Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, Francia	2079E	Pipeteo de muestras
Tubos Eppendorf Safe-Lock, 1,5 mL, Calidad Eppendorf	Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Francia	30120086	mezclar
Genio del vórtice 2	Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY 111716, Estados Unidos	SI-0236	mezclar
Centrífuga Mikro 200	Hettich Zentrifugen, D-78532, Alemania	0002020-02-00	centrifugación
Multipette E3	Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Francia	4987000010	distribución
Light Cycler 480 placa multipocillo 96, blanco	Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Alemania	4729692001	Lugar de reacción
Lámina de sellado Light Cycler 480	Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Alemania	4429757001	cobertura
LightCycler 480 Instrument II, 96 pocillos	Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Alemania	05015278001	Reacción en cadena de la polimerasa por fusión de alta resolución
Centrífuga Heraeus Megafuge 11R	Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, Francia	75004412	centrifugación
LightCycler 480 Maestro de fusión de alta resolución	Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Alemania	04909631001	Reactivos de reacción
Imprimación CN3: 5'ggccttagacttctcctgc 3'	Eurogentec Biologics Division, B4102 Seraing, Bélgica		Reactivo de reacción
Imprimación CN3re: 5'gttgacaaattggcggcttcg 3'	Eurogentec Biologics Division, B4102 Seraing, Bélgica		Reactivos de reacción
software light cycler 480 SW 1.5.1	Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Alemania		software utilizado para el análisis de datos de polimorfismo HRM-PCR CR1