Reacción en cadena de la polimerasa por gotas multiplex para detectar la metilación del ADN en leucocitos

Resumen

Fuente: Malic, L., et al. Methylation Specific Multiplex Droplet PCR utilizando un dispositivo generador de gotas de polímero para diagnóstico hematológico.J. Vis. Exp. (2020)

Este video demuestra la técnica de reacción en cadena de la polimerasa por gotas multiplex para la cuantificación simultánea de regiones de ADN metiladas en diferentes poblaciones de glóbulos blancos como biomarcador temprano para el diagnóstico clínico y el pronóstico.

Protocolo

1. Generación de gotas y PCR

NOTA: La Tabla 1 describe la información sobre los cebadores directos e inversos junto con las sondas de hidrólisis doblemente templadas para los genes C-LESS, CD3Z y Foxp3, que se requieren para la amplificación múltiple de objetivos génicos desmetilados.

1. Prepare la mezcla maestra como se describe en la Tabla 2.
2. Descongele todos los componentes de la mezcla maestra excepto la mezcla de enzimas. Mezcle bien la mezcla maestra pipeteando hacia arriba y hacia abajo y gire hacia abajo brevemente.
3. Añada el volumen adecuado (1 μL) de ADN convertido en bisulfito a la mezcla maestra en un tubo de PCR. Mezcle la reacción pipeteando hacia arriba y hacia abajo y gire hacia abajo brevemente.
4. Conecte el tubo fluídico desechable (diámetro interno de 0,25 mm, diámetro exterior de 1,6 mm) a dos jeringas de vidrio de precisión (volumen de 250 μL) mediante accesorios de PEEK.
5. Rellene previamente una jeringa de vidrio de precisión con 250 μl de aceite portador que contenga un 5 % de tensioactivo fluorado.
6. Rellene previamente otra jeringa de vidrio de precisión con 50 μL de aceite portador antes de cargar 100 μL de la mezcla de PCR para garantizar la dispensación de todo el volumen de muestra durante la emulsificación.
7. Instale un dispositivo microfluídico de gotas en una platina de un microscopio óptico vertical equipado con una cámara de alta velocidad para observar y registrar la formación de gotas en tiempo real.
8. Coloque las jeringas precargadas en la bomba de jeringa programable y, utilizando la unión de PEEK con accesorios (consulte la Tabla de materiales), conecte el tubo de las jeringas al tubo de los respectivos canales de entrada del dispositivo microfluídico de gotas.
9. Coloque el tubo desde la salida del generador de gotas dentro de un tubo de PCR de 0,5 mL.
10. Ajuste el caudal de la bomba de jeringa a 2 μL/min y permita que el tamaño de la gota se estabilice antes de recoger la emulsión resultante.
11. Recoja la emulsión y transfiera 75 μL a un tubo de PCR de 0,2 mL para el ciclo térmico.
12. Asegúrese de que el contenido de aceite en el tubo de PCR coincida estrechamente con el volumen de la fase dispersa para evitar la coalescencia de las gotas durante el ciclo térmico.
13. Coloque el tubo de PCR de 0,2 mL en un termociclador y realice el protocolo de ciclo de la siguiente manera: precalentamiento a 95 °C durante 5 min, luego 45 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 15 s y recocido/extensión a 60 °C durante 30 s.

Tabla 1: Diseño del cebador y de la sonda de hidrólisis.

FOXP3 Adelante	GGG TTT TGT TGT TAT AGT TTT TG
FOXP3 Reversa	TTC TCT TCC TCC ATA ATA TCA
Reenvío de CD3Z	GGA TGG TTG TGG TGA AAA GTG
CD3Z Reverso	CAA, AAA, CTC, CTT, TTC, TCC, TAA, CCA
C-LESS Adelante	TTG TAT GTA TGT GAG TGT GGG AGA GA
C-LESS Reversa	TTT CTT CCA CCC CTT CTC TTC C
Sonda FOXP3	/56-FAM/CA ACA CAT C/ZEN/C AAC CAC CAT /3IABkFQ/
Sonda CDZ3	/56-HEX/CC AAC CAC C/ZEN/A CTA CCT CAA /3IABkFQ/
Sonda C-Less	/56-CY5/CT CCC CCT C/ZEN/T AAC TCT AT/3IABkFQ/

Tabla 2: Receta de mezcla maestra para mdPCR.

Reactivo	Solución de stock	Volumen de mezcla maestra	Concentración de trabajo
Tris-HCl	1 M	2 μL	20 mM
Kcl	1 M	10 μL	100 mM
MgCl2	25 mM	16 μL	4 mM
Imprimaciones C-LESS	10 μM	10 μL	1 μM cada uno
Imprimadores CD3Z	10 μM	10 μL	1 μM cada uno
Imprimaciones FOXP3	10 μM	10 μL	1 μM cada uno
Sonda C-LESS	10 μM	5 μL	500 nM
Sonda CD3Z	10 μM	5 μL	500 nM
Sonda FOXP3	10 μM	5 μL	500 nM
ADN polimerasa HotStarTaq	5 Unidades/μL	8 μL	0.4 Unidades/μL
Diana de ADN tratada con bisulfito	variable	variable	variable
Agua libre de nucleasas		variable
Volumen total		100 μL

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubo de PCR	Bio-Rad, Mississauga, ON	TFI0201
Tensioactivo fluorado	RAN Biotechnologies, Beverly, MA	008-FluoroTensioactivo
Tubo fluídico desechable	dolomita	3200063
Tubo fluídico desechable	dolomita	3200302
Herrajes de PEEK	IDEX Salud y Ciencia, Oak Harbor, WA	P-881
Aceite portador	3M, San Pablo, MN
Microscopio óptico vertical	Nikon, Melville, NY