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1. Control de calidad del ADN genómico
NOTA: El ADN genómico (ADNg) se extrajo de la sangre periférica utilizando el método de purificación de ADN basado en membrana de sílice bien establecido. Antes de los siguientes procedimientos, la concentración de ADNg se determinó utilizando un espectrofotómetro.
- Prepare la muestra de ADNg a una concentración de 10-100 ng/μL.
- Agregue 10 μL de tampón de muestra de ADN a una tira de 8 tubos.
- Agregue 1 μL de escalera de ADN o ADNg a los tubos. Agite la mezcla durante 1 minuto con el accesorio de microplaca.
- Cargue el tubo, el dispositivo de gel y las puntas de pipeta en el instrumento de electroforesis (Tabla de materiales) e inicie la carrera presionando el botón 'Inicio'.
nota: El sistema de electroforesis funcionará automáticamente con un clic en el botón Inicio.
- Confirme que el marcador inferior contenido en el tampón de muestra de ADN está asignado correctamente en los electroferogramas. Si está asignado incorrectamente, asigne manualmente el marcador en el 'Modo Electroherograma' del software.
nota: El número de integridad del ADN (DIN) se calculará automáticamente. El valor DIN proviene de la integridad del ADN. Los valores DIN altos y bajos indican ADNg muy intacto y fuertemente degradado, respectivamente.
- Especifique el tamaño de la región del ADNg (> 200 pb) en el 'Modo de región' del software para calcular automáticamente la concentración de ADNg (> 200 pb).
2. Diseño de cebadores y sondas
- Calcule los valores de temperatura de fusión (Tm) utilizando cualquier herramienta de acceso abierto en las siguientes condiciones: 10-25 bases, 50 mM Na+/K+, 0,80 mM dNTPs y 3 mM Mg2+ (Tabla de Materiales). Diseñar los cebadores directos e inversos para amplificar la región genómica que contiene alelos diana con un valor de Tm de alrededor de 60 °C y una longitud de amplicón de 100-300 pb.
NOTA: Consulte la Tabla 1 para conocer la concentración de oligonucleótidos.
- Diseñar las sondas de ácido nucleico bloqueado (LNA) para los alelos de referencia y variantes en función de las siguientes condiciones: (i) hay de 1 a 6 LNA presentes en cada sonda; (ii) un colorante fluorescente y un extintor están presentes en los extremos 5' y 3' de cada sonda, respectivamente; iii) la diferencia entre los valores de Tm de las sondas emparejadas y no coincidentes es de > 10 °C; (iv) Los valores de Tm de las sondas emparejadas y no emparejadas son más altos y más bajos que los de los cebadores, respectivamente [por ejemplo, cebador directo: 60,8 °C, cebador inverso: 59,8 °C, sonda alélica de referencia (coincidente/no coincidente): 62,6/45,3 °C, sonda alélica variante (coincidente/no coincidente): 61,7/50,5 °C]. Los valores de Tm se calcularon utilizando la herramienta de acceso abierto también utilizada para el paso 2.1.
- Asegúrese de que los cebadores y sondas diseñados no abarquen los polimorfismos de un solo nucleótido con una frecuencia de > 0,1 % según lo determinado a partir de bases de datos [por ejemplo, la base de datos de polimorfismos de un solo nucleótido (dbSNP)].
3. PCR digital
- Prepare los cebadores, las sondas y las soluciones madre de ADNg en las concentraciones descritas en la Tabla 1 con un tampón TE y guárdelos a -20-4 °C.
- Mezclar los reactivos a temperatura ambiente en un volumen total de 15 μL hasta obtener la concentración final descrita en la Tabla 1.
- Agregue 3 μL de agua destilada en lugar de ADNg en un control sin plantilla (NTC).
- Prepare 3,5 veces la cantidad de la mezcla de PCR por triplicado para tener en cuenta el error de pipeteo.
- Pipetea la mezcla de PCR hacia arriba y hacia abajo para mezclarla.
- Coloque la plataforma de carga en las virutas integradas en la tira de 8 tubos y colóquelas en el cargador automático. Asegúrese de que haya contacto entre el chip y la plataforma de carga.
- Coloque un deslizador de carga en la plataforma y sostenga el deslizador con el tope fuera del cargador.
- Pipetee 15 μL de la mezcla de PCR en la plataforma cerca de la punta del deslizador (Figura 1A).
- Ejecute el cargador presionando el botón del cargador (durante aproximadamente 1 min).
nota: No es un problema si queda una pequeña cantidad de mezcla de PCR en la plataforma. Es posible volver a ejecutar secuencialmente el cargador.
- Coloque el chip en un tubo lleno de mezcla de PCR en la ranura lateral del potenciador de sellado. Empuje la tapa deslizante y el borde de la tapa superior para no romper el chip (Figura 1B).
- Encienda el potenciador de sellado (aproximadamente 2 min). Vuelva a ejecutar secuencialmente el potenciador de sellado durante 1 minuto si aún se ve un charco de líquido porque un sellado incompleto provoca la contaminación cruzada de las señales positivas (Figuras 1C y 1D).
- Agregue 230 μL de líquido de sellado, un reactivo a base de aceite, a los tubos.
nota: Los chips ahora deben sumergirse en el fluido.
- Coloque los tubos en el termociclador. Haga funcionar el termociclador como se describe en la Tabla 2 (durante aproximadamente 2 h). Ajuste la temperatura o la duración de la PCR si hay una distribución desigual de particiones positivas (Figura 1E).
NOTA: Se recomienda ajustar la velocidad de rampa a alrededor de 1 °C/s.
- Deje los tubos en el termociclador durante al menos 15 minutos para reducir el ruido de referencia.
nota: Los tubos también se pueden dejar toda la noche. Las señales de fluorescencia se detectaron incluso al día siguiente.
- Coloque los tubos en la plantilla de detección y vierta 6 ml de agua destilada en la plantilla. Si hay burbujas de aire visibles dentro y fuera de los tubos, límpialas (Figuras 1F y 1G).
- Cargue la plantilla en el detector y ejecútela con un clic en el botón 'Ejecutar' del software después de la selección de las pestañas Fluorescencia, Experimento y Muestra/NTC (Tabla de Materiales).
NOTA: La detección de doble color de ocho muestras con una intensidad predeterminada tarda aproximadamente 4 a 5 minutos.
- Confirme la gráfica de posición, el histograma y el diagrama de dispersión 2D.
NOTA: Si la intensidad de fluorescencia de las particiones negativas es alta, ajuste la intensidad con un clic en el botón Configuración del software para que esté dentro del rango de 30 a 70.
- Calcule la fracción alélica variante (VAF) utilizando la siguiente fórmula:
Aquí, Cv y Cr son los números de copia de la variante y del alelo de referencia, respectivamente.
nota: Se calculan automáticamente en el programa de software basado en las estadísticas de Poisson.
4. Recolección de producto PCR
- Retire el líquido de sellado del tubo.
- Añada 100 μL de tampón TE al tubo. Agite el vórtice vigorosamente durante 30 s y centrifugar brevemente el tubo.
- Transfiera la solución de TE a otro tubo y agregue 30 μL de acetato de sodio 3 M y 200 μL de etanol.
- Enfríe la solución a -20 °C durante la noche.
- Centrifugar la solución durante 30 min a 16.000 x g y retirar el sobrenadante.
- Agregue 300 μL de etanol al 80% al tubo y al vórtice.
- Centrifugar la solución durante 15 min a 16.000 x g y eliminar el sobrenadante. Deja que el precipitado se seque al aire durante 5 min.
- Disuelva el precipitado en 1-5 μL de tampón TE después del secado al aire.
- Si es necesario, evalúe el tamaño del producto utilizando un instrumento de electroforesis con referencia al paso 1. Cargue 1 μL de la solución en el dispositivo de gel para una alta sensibilidad (Tabla de materiales).
