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Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.
NOTA: Este procedimiento está diseñado específicamente para la detección de un bajo número de moléculas de ADNc en tejidos humanos frescos congelados. Las secciones de tejido se han cortado en hielo seco, mientras aún están congeladas, a partir de muestras de tumor gástrico derivado del paciente o de tejido normal previamente validadas.
1. Aislamiento y purificación de ARN
- Extracción de ARN
nota: El aislamiento del ARN se realiza bajo el capó utilizando un producto específico (ver Tabla de Materiales). Sin embargo, hay una variedad de kits de aislamiento disponibles comercialmente.
- Homogeneizar 50 - 100 mg de una muestra de tejido fresco congelado finamente cortada en un tubo de 1,5 mL con 1 mL de reactivo de aislamiento de ARN y vórtice vigorosamente durante 15 s. Incubar los tubos a -80 °C durante la noche.
- Incubar el tubo que contiene la muestra a temperatura ambiente durante 5 min y mezclar mediante vórtice durante 15 s.
- Mantenga el tubo en hielo, agregue 200 μL de cloroformo y agite vigorosamente durante 15 s.
- Incubar los tubos a temperatura ambiente durante 60 s y centrifugarlos a 12.000 x g durante 15 min a 4 °C.
- Transfiera la fase acuosa a un tubo de 1,5 mL y agregue 20 μg de glucógeno.
nota: Es importante evitar cuidadosamente la transferencia de cualquiera de las capas de interfase u orgánicas para reducir la contaminación.
- Añadir 500 μL de isopropanol, invirtiendo el tubo para mezclar, e incubar en hielo durante 10 min.
- Centrifugar el tubo a 12.000 x g durante 15 min a 4 °C para precipitar RNA.
nota: El ARN estará presente en una bolita similar a un gel en el costado y en la parte inferior del tubo, a menudo invisible después de la centrifugación.
- Retirar el sobrenadante sin alterar el precipitado y lavarlo con 1 mL de etanol al 75% por pipeteo.
- Centrifugar el tubo a 7.500 x g durante 5 min a 4 °C y retirar el sobrenadante sin alterar el pellet.
- Deje secar el pellet hasta que el precipitado se vuelva transparente y disuélvalo en 50 μL de agua libre de RNasa.
- Congelar las muestras a -80 °C al menos durante la noche antes de la cuantificación.
- Eliminación genómica de ADN y purificación de ARN
nota: Se recomienda una etapa de digestión de la DNasa, seguida de una purificación de ARN basada en columnas, para los análisis de objetivos de baja abundancia con el fin de digerir el ADN contaminante.
- Disolver la DNasa I liofilizada (1.500 unidades de Kunitz) en 550 μL de agua libre de RNasa con una jeringa, mezclar suavemente invirtiendo el vial y dividir la solución madre reconstituida en alícuotas.
- Transfiera en un tubo de 1,5 mL el volumen calculado de la muestra con 15 μg de ARN, 10 μL de tampón de digestión de DNasa del kit (enumerado en la Tabla de materiales), 2,5 μL de solución madre de DNasa I y agua libre de RNasa a 100 μL. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
- Añadir 350 μL de tampón de lisis tisular (del kit, ver Tabla de Materiales) y mezclar mediante pipeteo.
- Añadir 250 μL de etanol al 100% y mezclar por pipeteo.
- Transfiera todo el volumen (700 μL) a una nueva columna de centrifugación y centrifuga a 12.000 x g durante 15 s.
- Transfiera el filtro a un nuevo tubo de recolección, agregue 500 μL de etanol al 80% a la columna y centrifugue a 12,000 x g durante 2 minutos.
- Abra la tapa de la columna de centrifugación y centrifuga a 12.000 x g durante 5 minutos con un nuevo tubo de recolección para secar el filtro; luego transfiera el filtro a un tubo de 1,5 mL.
- Añadir 14 μL de agua libre de RNasa directamente a la columna de filtro y centrifugar a 12.000 x g durante 1 min.
- Mantenga las muestras en hielo y proceda a la cuantificación utilizando 2 μL de la muestra en un espectrofotómetro de sobremesa o almacene el ARN a -80 °C hasta su uso.
2. Configuración de reacción de PCR digital
- Mezcla de reacción dPCR y preparación de muestras
- Descongele la mezcla maestra y el ensayo a temperatura ambiente durante al menos 20 minutos.
- Diluir las muestras de ADNc a una concentración de 300 ng en 6 μL de agua.
- Agite suavemente la mezcla maestra y prepare la mezcla en un tubo estéril con 8,7 μL de mezcla maestra, 0,87 μL del cebador de ensayo diseñado a medida CDH1a y 1,83 μL de agua libre de nucleasas para un volumen final de 11,4 μL.
nota: Para conocer los detalles del cebador de ensayo diseñado a medida CDH1a, consulte la Tabla de materiales.
- Transfiera 11,4 μL de la mezcla preparada a la muestra de ADNc diluida, mezcle suavemente y centrifugue brevemente.
nota: Los volúmenes incluyen un exceso del 20% para compensar la pérdida de volumen del pipeteo. Prepare la mezcla para todas las muestras y un control sin plantilla (NTC).
- Preparación de virutas
Nota: Para obtener resultados óptimos, cargue las fichas lo antes posible.
- Enchufe el cargador de chips y espere hasta que la luz indicadora se vuelva verde.
- Retire el tapón de la jeringa de líquido de inmersión tirando suavemente hacia atrás del émbolo 1 - 2 mm y soltándolo para facilitar este paso, y reemplácelo con una punta.
- Tome un chip nuevo y tome nota del código escrito en la tapa para asociarlo con la muestra.
- Sostenga la tapa con cuidado a un lado, retire la película protectora y coloque la tapa con la tapa pegajosa hacia arriba en la orientación correcta.
- Recoja con cuidado una viruta, teniendo cuidado de no tocar la parte interna, y cárguela en el nido de virutas en la posición correcta presionando la palanca para abrir la abrazadera.
- Cargue una nueva cuchilla de carga en el cargador y empújela suavemente para asegurarse de que esté firmemente en su lugar.
- Transfiera 14,5 μL de la mezcla de reacción dPCR a la cuchilla de carga sin hacer burbujas de aire ni desviar la cuchilla, después de lo cual presione el botón negro de carga para distribuir el volumen en el chip.
- Utilice la jeringa de líquido de inmersión para transferir unas 20 gotas a la superficie del chip, teniendo cuidado de no tocar la superficie con la punta.
nota: Es importante cubrir toda la superficie sin derramar líquido por los bordes.
- Gire el brazo del cargador para que la tapa entre en contacto con la viruta y presione hacia abajo durante 15 s.
- Presione el botón de la tapa para liberar el chip y devolver el brazo a su posición.
- Sostenga el chip ensamblado en un ángulo de 45° y dispense con cuidado el líquido de inmersión con la jeringa a través del puerto de llenado, gire el chip ligeramente para asegurarse de que no haya burbujas de aire y elimine el exceso de líquido con una toallita estéril.
- Selle la caja de chips despegando suavemente la etiqueta de la parte superior de la tapa de chips y presione sobre el puerto de llenado durante al menos 5 s.
- Guarde el chip en la oscuridad hasta que esté listo para cargarlo en el termociclador.
nota: Las patatas fritas preparadas deben utilizarse en un plazo de 2 horas.
- Reacción de dPCR
- Abra la tapa e instale los adaptadores en ambos bloques, incluso cuando se utilice un solo bloque.
- Coloque las virutas en el bloque de muestra en la posición correcta.
nota: El puerto de llenado debe estar orientado hacia la parte delantera del termociclador en una posición elevada para permitir que las burbujas de aire floten hacia la parte superior sin perturbar la ventana del chip. Usa fichas vacías para equilibrar los dos bloques.
- Coloque la almohadilla térmica sobre el bloque de muestra para cubrir completamente las virutas.
- Cierre la tapa e inicie la ejecución de PCR, aplicando las siguientes condiciones: mantener a 96 °C durante 10 min; 45 ciclos de 60 °C durante 2 min y 98 °C durante 30 s; mantener a 60 °C durante 2 min; mantener a 4 °C. Apagar el termociclador y descongelar los chips a temperatura ambiente durante al menos 10 min.
nota: El análisis de virutas debe realizarse en el plazo de una hora.
- Análisis de chips
- Abra la tapa del instrumento y retire las almohadillas térmicas, luego retire las virutas de los adaptadores.
nota: Guarde los chips en un lugar oscuro y limpio hasta su análisis.
- Limpie la superficie de la viruta con isopropanol y una toallita estéril.
nota: Inspeccione cada chip en busca de fugas o posibles problemas.
- Inserte el USB en el sistema detector para guardar los datos.
- Abra la bandeja de virutas del sistema de detección, cargue la viruta boca arriba en la posición correcta y, a continuación, cierre la bandeja.
- Espere 30 segundos para el procesamiento, luego retire el chip e inserte el siguiente.
- Espere a que se complete el análisis de todos los chips procesados y luego inserte el USB en una computadora para transferir los archivos.
nota: El tiempo total de análisis es de alrededor de 2 a 3 min/chip.
3. Análisis e interpretación de datos
- Conéctese a la plataforma de software basada en la nube necesaria para llevar a cabo todos los análisis posteriores.
- Cree un proyecto e importe todos los archivos de datos de los chips de interés.
- Introduzca el nombre de la muestra; seleccione el colorante y el ensayo utilizados en la pestaña "Definir fichas".
- Determine si el chip es aceptable visualizándolo en la pestaña "Revisar datos", verificando qué tan completamente se cargó la muestra en el chip y cuántos puntos de datos son evaluables.
nota: Rechace chips con menos de 13.000 puntos de datos evaluables.
- Continúe con el diagrama de dispersión del chip seleccionado en el lado derecho de la pantalla; aplique un umbral de 6,000 para las señales de colorante reportero de amidita de fluoresceína (FAM) (eje Y) a todos los chips><.
nota: La configuración del umbral puede variar en función de los ensayos utilizados.
- Elimine cualquier señal positiva dudosa para evitar resultados falsos positivos seleccionando el punto relativo en el diagrama de dispersión con la herramienta de lazo y presionando "indeterminado". Todos los puntos positivos restantes indican la presencia de copias de ADNc del raro objetivo analizado.