PCR digital basada en chip para detectar variantes raras de transcripción utilizando un chip nanofluídico

Abstract

Fuente: Molinari, C., et al. Detección de una variante rara de la transcripción de CDH1 en tejidos de cáncer gástrico recién congelados mediante PCR digital basada en chip. J. Vis. Exp. (2018).

Este video muestra la PCR digital basada en chip, una variación de la técnica de PCR digital que es útil para detectar variantes raras de transcripción. La reacción de PCR se divide en las cámaras de un chip nanofluido, cada una de las cuales actúa como una reacción independiente. La detección de señales de fluorescencia de las cámaras con objetivos amplificados confirma la presencia de variantes raras de transcripción en la muestra.

Protocol

Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.

NOTA: Este procedimiento está diseñado específicamente para la detección de un bajo número de moléculas de ADNc en tejidos humanos frescos congelados. Las secciones de tejido se han cortado en hielo seco, mientras aún están congeladas, a partir de muestras de tumor gástrico derivado del paciente o de tejido normal previamente validadas.

1. Aislamiento y p....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reactivo TRIazol	Thermo Fisher Scientific	15596018
Glucógeno 20 mg/ml	Roche	10901393001
Kit de limpieza RNeasy MinElute	QIAGEN	74204
Kit de síntesis de ADNc iScript	BioRad	1708891
QuantStudio 3D Digital PCR Master Mix v2	Thermo Fisher Scientific	A26358
Ensayo de diseño personalizado CDH1a IDT	Tecnologías integradas de ADN (IDT)	Na	F) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG (R) ACTTTGAATCGGGTGTCGAG (P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/ [Concentraciones de ensayo optimizadas para dPCR: 900 nM (F), 900 nM (R), 250 nM (P)]
Kit de chip QuantStudio 3D Digital PCR 20K v2	Thermo Fisher Scientific	A26316
Fresco de Heraeus Biofuge	Termo Científico	75002402
Termociclador (Labcycler)	Sensoquest	011-103
Sistema de PCR GeneAmp 9700	Thermo Fisher Scientific	N805-0200
Módulo de muestra de bloque plano doble	Thermo Fisher Scientific	4425757
Base inclinable QuantStudio 3D para el sistema de PCR GeneAmp de bloque plano doble 9700	Thermo Fisher Scientific	4486414
Kit adaptador de chip PCR digital QuantStudio 3D para termociclador de bloque plano	Thermo Fisher Scientific	4485513
Cargador de chips PCR digital QuantStudio 3D	Thermo Fisher Scientific	4482592
Instrumento de PCR digital QuantStudio 3D con cable de alimentación	Thermo Fisher Scientific	4489084