Ensayo de transferencia de puntos para cuantificar el genoma viral

NOTA: Las recetas para las soluciones y los tampones necesarios para este protocolo se proporcionan en la Tabla 1.

1. Mancha de puntos

1. Preparación de patrones de ADN plasmídico
   1. Diluir el ADN del plásmido del genoma del vector AAV a 10 ng/μL en agua o tampón Tris-HCl (10 mM, pH 8,0). Tome 25 μL de esta dilución y digiera con una enzima de restricción adecuada durante 1 h para linealizar el ADN plasmídico en un volumen de reacción de 50 μL.
      nota: Hacemos un conjunto duplicado de digestión (ver paso 1.4.1). La enzima apropiada debe ser una que corte el ADN plasmídico fuera de la región de unión de la sonda de transferencia de puntos. Para mayor comodidad, el ADN plasmídico diluido puede ser alícuota (25 μL/tubo) y almacenarse congelado a -20 °C para su uso futuro. Digiera el ADN plasmídico mientras los tubos se agitan en el paso 5.1. No digiera en exceso el estándar de ADN plasmídico.
   2. Agregue 450 μL de agua o TE al tubo que contiene el patrón de ADN plasmídico digerido y mezcle bien. Transfiera 70 μL de esta mezcla a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL con 1.330 μL de agua o TE para hacer un patrón de plásmido diluido (25 pg/μL).
   3. Siga la Tabla 1 para crear un conjunto de diluciones en serie dobles (600 μL/tubo). Mezclar bien las diluciones mediante vórtice durante 5 s.
2. Desnaturalización de patrones y muestras de ADN viral
   1. Añadir 600 μL de solución alcalina 2x a cada dilución estándar. Mezclar bien mediante vórtice durante 5 a 10 s. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
   2. Agregue 120 μL de solución alcalina 2x a cada muestra de ADN viral. Mezclar bien mediante vórtice durante 5 a 10 s. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
3. Configuración del aparato de transferencia de puntos
   1. Con unas tijeras, corte una membrana secante (por ejemplo, zeta-sonda) a un tamaño apropiado para el número de muestras y estándares. Remoje la membrana con agua durante 10 minutos antes de colocarla en un aparato de manchas de puntos. Cubra los pozos no utilizados en el aparato de membrana.
      nota: Manipule la membrana con pinzas limpias. Para cubrir pozos vacíos, se puede utilizar la lámina de protección azul claro que viene con la membrana. No permita que la membrana se seque antes de unir las muestras y los estándares. Para obtener más detalles sobre el montaje y el uso del aparato, consulte el manual del usuario.
   2. Agregue agua a los pozos en los que se cargarán las muestras. Aplique la aspiradora y extraiga el agua a través de los pozos para verificar si hay errores y vuelva a realizar la prueba cuando se solucione. Vuelva a apretar los tornillos mientras aplica vacío para garantizar un sellado hermético.
      nota: Un sellado incompleto puede causar fugas de muestra entre los pocillos.
   3. Una vez que el agua haya pasado por completo, libere el vacío por completo (es decir, el colector de vacío debe estar abierto a la presión del aire).
4. Carga de patrones y muestras en el aparato de transferencia de puntos
   1. Aplique 400 μL de cada patrón de ADN plasmídico diluido a cada pocillo y ejecute cuatro carriles de diluciones estándar. Utilice dos alícuotas separadas del resumen estándar y cargue cada una por duplicado. Aplique 200 μL/pocillo de cada muestra de ADN viral.
      nota: Utilizando los ~40 μL restantes de muestras desnaturalizadas, se pueden preparar muestras diluidas (por ejemplo, muestras diluidas 10 veces utilizando 20 μL de la muestra más 180 μL de 1x solución alcalina) y secar si es necesario.
   2. Aplique un vacío suave para extraer las soluciones de ADN a través del pocillo.
      nota: La presión de vacío debe ajustarse abriendo parcialmente una válvula de tres vías para que la presión de vacío se aplique al aparato de transferencia de puntos, así como a la atmósfera (es decir, con los brazos de la llave de paso colocados en un ángulo de aproximadamente 45 ° donde hace un ruido de succión más fuerte).
   3. Una vez que se hayan vaciado todos los pocillos, libere el vacío ajustando la válvula de tres vías. Agregue 400 μL de 1x solución alcalina a cada pocillo que contuviera patrones y muestras. Espere 5 minutos antes de volver a aplicar la aspiradora para vaciar los pocillos.
   4. Vuelva a aplicar la aspiradora de la misma manera.
   5. Desmonte el aparato de mancha de puntos debajo de la aspiradora, retire la membrana y enjuáguelo con 2x SSC. Coloque la membrana sobre una toalla de papel limpia con el lado unido al ADN hacia arriba para eliminar el exceso de SSC 2x.
   6. Reticulación UV del ADN borrado a la membrana con un reticulante UV apropiado; la membrana ahora está lista para la hibridación.
      nota: Las membranas húmedas se pueden utilizar para la reticulación UV. Las membranas reticuladas UV secas se pueden almacenar a temperatura ambiente. Más información en la Tabla de Materiales.

2. Hibridación y lavado

1. Calentar el tampón de hibridación en un baño de agua a 65 °C.
2. Marcar enzimáticamente una sonda de ADN con ^α-32P dCTP radiactivo y purificarla utilizando kits disponibles comercialmente de acuerdo con la recomendación del fabricante.
   nota: Utilizamos una sonda de 0,5 a 2,0 kb de longitud de una región potenciadora-promotora o de una secuencia codificante de proteínas en el genoma viral. Aunque este protocolo utiliza ³²sondas radiactivas marcadas con P para la detección de señales, también se pueden utilizar sondas quimioluminiscentes o fluorescentes no radiactivas (consulte la sección de discusión).
3. Coloque la membrana en una botella de hibridación con el lado unido al ADN hacia arriba, enjuague la membrana con 5 ml de tampón de hibridación precalentado y deseche el tampón. A continuación, añada 10 ml de tampón de hibridación precalentado y coloque el frasco en un horno de hibridación giratorio ajustado a 65 °C. Gire durante ≥5 min.
4. Desnaturalización por calor de 20 μL de 10 mg/mL de solución de ADN de esperma de arenque o salmón esquilado y la sonda marcada con ³²P (≥10⁷ cpm) durante 5 min colocando los tubos en un bloque térmico ajustado a 100 °C. A continuación, enfríelos en hielo durante ≥2 minutos, gírelos brevemente y manténgalos en hielo hasta que se utilicen.
   cautela: Para las sondas de ADN radiactivo, se deben utilizar tubos de 1,5 mL con tapones de rosca y juntas tóricas.
5. Agregue rápidamente el ADN de los espermatozoides desnaturalizados y la sonda radiactiva al tampón de hibridación en el frasco de hibridación y agite el frasco durante 10 segundos para mezclar. Vuelva a colocar el biberón en el horno a 65 °C e incube el frasco rotándolo a 65 °C durante ≥4 h.
6. Una vez completada la hibridación, detenga la rotación, retire la botella de hibridación y luego vierta la solución de la sonda radiactiva en un tubo cónico de 50 mL con una tapa de sellado de tapón a prueba de fugas. Guarde la sonda en un recipiente apropiado colocado en un refrigerador designado para materiales radiactivos.
   nota: El tampón de hibridación usado con una sonda que se almacena a 4 °C se puede reutilizar al menos 5 veces colocando el tubo cónico de 50 ml con una tapa de sellado de tapón a prueba de fugas que contiene tampón de hibridación en un baño de agua a 100 °C durante 5 min.
7. Lave la membrana con tampón de lavado calentado a 65 °C. Agregue de 20 a 30 ml de tampón de lavado a la botella de hibridación y gire durante 5 min. Repita este lavado 2 veces más.
   nota: Mida la radiactividad de las soluciones de lavado y regístrela si así lo requiere el instituto local.
8. Mientras lava la membrana, coloque una pantalla de imágenes de fósforo en un borrador de imágenes durante 5 minutos.
9. Después del tercer lavado, retire la membrana de la botella de hibridación, retire el exceso de tampón de la membrana con toallas de papel y coloque la membrana en un soporte de papel de plástico transparente. Compruebe las señales radiactivas en la membrana utilizando un contador Geiger. Exponga la pantalla de imágenes de fósforo borrado a la membrana durante 10 minutos o toda la noche, dependiendo de la intensidad de la señal.
10. Escanee la pantalla utilizando un sistema de escaneo de imágenes de fósforo y obtenga los datos sobre la intensidad de la señal de cada punto.

Tabla 1: Patrones cuantitativos de ADN plasmídico de transferencia de puntos. Se muestran los volúmenes necesarios de 25 pg/μL de solución estándar de ADN plasmídico y agua o TE para preparar patrones de ADN plasmídico mediante diluciones en serie dobles (600 μL/tubo). Los números en la columna estándar de ADN plasmídico (0,039 a 5 ng) son la cantidad de ADN en 200 μL de cada solución estándar de ADN plásmido.