1. Preparación de la muestra
- Tome 50 mg de tejido de ratón en un tubo de 1,5 ml. Añadir 200 μL de tampón de lisis (50 mM de HEPES, pH 7,4, 137 mM de NaCl, 5 mM de EDTA, 5 mM de EGTA, 1 mM de MgCl2, 10 mM de Na2P2O7, 1% de Triton X-100, 10% de glicerol), suplementado con inhibidores de la proteasa y la fosfatasa (100 mM de NaF, 0,1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 5 μg/mL de pepstatina, 10 μg/mL de leupeptina, 5 μg/mL de aprotinina).
- Homogeneizar el tejido con un homogeneizador durante 1 min en hielo.
- Centrifugar durante 10 min a 8.000 x g a 4 °C.
- Recoja el sobrenadante en tubos nuevos (1,5 mL) y extraiga 1 μL para el ensayo de concentración de proteínas con un kit de BCA.
NOTA: Todos los tampones de lisis comúnmente utilizados para el análisis de Western blot y el análisis de Dot blot se pueden utilizar para el análisis QDB.
2. Determinación de la especificidad del anticuerpo
- Prepare muestras de lisados (20 μg) en la sección 1.4, BSA libre de IgG (20 μg) y proteína estándar (600 pg), para el análisis de Western blot.
NOTA: La BSA sin IgG se utiliza como control negativo y la proteína estándar se utiliza como control positivo. La especificidad del anticuerpo se demuestra mostrando una banda del tamaño correcto mediante el análisis de Western blot.
3. Definiendo el rango lineal del análisis QDB
- Disuelva la proteína estándar con ddH2O. Diluya la proteína hasta una concentración de 1.200 pg/μL.
- Diluir la proteína concentrada de las muestras preparadas en la sección 1.4 a 4 μg/μL.
- Disolver el BSA con ddH2O. Diluir la proteína a una concentración de 1.200 pg/μL y 4 μg/μL.
- Se prepararon una serie de diluciones de proteína estándar y muestras preparadas con la guía de la Tabla 1 y la Tabla 2.
- Mezcle 10 μL de proteína estándar de dilución o muestras preparadas con dilución y 10 μL de tampón de carga 2x (120 mM de Tris-HCl pH 6,8, 20 % de glicerol, 4 % de SDS, 0,2 % de azul de bromfenol, 200 mM de DTT).
- Calentar las mezclas a 85 °C durante 5 min.
4. Proceso de análisis QDB
- Ejemplo de aplicación
- Apoye la placa QDB para evitar que la parte inferior de la placa toque la superficie de la mesa. Por ejemplo, utilice una caja de puntas de pipeta vacía como soporte.
- Cargue hasta 2 μL de la muestra en el centro de la membrana en la parte inferior de la unidad individual de la placa QDB.
- Secado de la placa
- Deje la placa QDB cargada durante 1 h a temperatura ambiente (RT) o, como alternativa, deje la placa cargada a 37 °C durante 15 minutos en un espacio bien ventilado.
- Bloqueo de la placa
- Sumerja la placa QDB en el tampón de transferencia (0,039 M de glicina, 0,048 M Tris, 0,37 % SDS, 20 % de alcohol metílico) y agite suavemente la placa durante 10 s.
- Enjuague la placa QDB suavemente con TBST (solución salina tamponada con Tris, 0,1% Tween 20) tres veces y luego lave la placa durante 5 minutos en TBST bajo agitación constante.
- Bloquee la placa QDB con tampón de bloqueo (leche descremada al 5% en TBST (100 μL/pocillo) durante 1 h bajo agitación constante.
- Incubación primaria de anticuerpos
- Diluir el anticuerpo primario en el tampón de bloqueo a una concentración elegida (de 1:500 a 1:5.000) y añadir 100 μL a cada pocillo individual de una placa ordinaria de 96 pocillos. Inserte la placa QDB en la placa de 96 pocillos e incube las placas combinadas durante 2 h a RT o durante la noche a 4 °C bajo agitación constante.
- Alternativamente, coloque la placa QDB dentro de una caja y llene la caja con un tampón de bloqueo de 2 a 3 mm por encima de la parte de la membrana de la placa si se usa el mismo anticuerpo para toda la placa. Añadir el anticuerpo primario a la concentración elegida e incubar la placa durante 2 h a RT o toda la noche a 4 °C bajo agitación constante.
- Enjuague la placa suavemente con TBST tres veces antes de lavarla con TBST tres veces, cada vez durante 5 minutos bajo agitación constante.
- Incubación secundaria de anticuerpos
- Diluir el anticuerpo secundario en el tampón de bloqueo a la concentración elegida (de 1:1.000 a 1:50.000), y alícuota 100 μL/pocillo en una placa de 96 pocillos o en una caja como se describe en la sección 4.4.2 y, a continuación, incubar la placa QDB dentro de la placa de 96 pocillos cargada o en la caja durante 1 h a RT bajo agitación constante.
- Enjuague la placa QDB suavemente 3 veces con TBST, luego lave la placa 3 veces, 5 minutos cada una con TBST bajo agitación constante.
- cuantificación
- Prepare el sustrato de quimioluminiscencia mejorada (ECL) siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Aliquot ECL sustrato en una placa de 96 pocillos (100 μL/pocillo) e inserte la placa QDB dentro de la placa de 96 pocillos durante 2 minutos bajo agitación constante.
- Retire la placa QDB de la placa de 96 pocillos y agite brevemente para eliminar el exceso de líquido. Coloque la placa sobre una placa de microtitulación blanca.
- Encienda el lector de microplacas y seleccione "placa con cubierta" en la interfaz de usuario antes de colocar las placas combinadas (placa QDB + adaptador de placa blanca) dentro del lector de microplacas para la cuantificación.
NOTA: Asegúrese de utilizar la placa de microtitulación blanca y no transparente como adaptador para evitar cualquier interferencia de la placa. Asegúrese de elegir "placa con cubierta" para evitar atascar la máquina cuando se coloquen placas combinadas (placa QDB + adaptador de placa de 96 pocillos) dentro del lector de microplacas.
Tabla 1. Esquema de dilución para la curva estándar de proteínas.
| S1
(0pg/μl) | S2 (33,3 pg/μl) | S3
(100pg/μl) | S3
(300pg/μl) | S5
(600 pg/μl) | S6
(1200pg/μl) |
| Proteína estándar (1200pg/μl) | 0 | 1.39 | 4.17 | 12.5 | 25 | 50 |
BSA
(4pg/μl) | 50 | 48.61 | 45.83 | 37.5 | 25 | 0 |
| total | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
Tabla 2. Esquema de dilución para muestras preparadas
| X1
(0 μg/μl) | X2
(0,25 μg/μl) | X3
(0,5 μg/μl) | X4
(1 μg/μl) | X5
(2 μg/μl) | X6
(4 μg/μl) |
| Muestra (4 μg/μl) | 0 | 3.125 | 6.25 | 12.5 | 25 | 50 |
| BSA libre de IgG (4 μg/μl) | 50 | 46.875 | 43.75 | 37.5 | 25 | 0 |
| total | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
