>NOTA: Este protocolo ha sido optimizado utilizando kits y reactivos estandarizados disponibles comercialmente para aumentar la reproducibilidad (ver Tabla de Materiales).
1. Preparación de muestras
- Extracción de proteínas
- Transfiera muestras de células o tejidos congeladas a presión de -80 °C en hielo seco, descongele en hielo y lave según sea necesario con solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x helada. Evite los ciclos innecesarios de congelación y descongelación, ya que esto afectará a la calidad de la proteína.
- Añada tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) (25 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM de NaCl, 1% de NP-40, 1% de desoxicolato de sodio, 0,1% de SDS) que contenga 1x inhibidor de la proteasa a cada muestra, utilizando la cantidad óptima por peso de tejido
nota: Dependiendo de la aplicación, el tipo y la cantidad de búfer de homogeneización pueden necesitar una mayor optimización.
- Utilice un homogeneizador eléctrico de mano con un mortero de polipropileno para homogeneizar las muestras de tejido. Entre cada muestra, lavar el mortero con agua bidestilada y secarlo con un pañuelo limpio. Cambie el mortero entre diferentes condiciones experimentales y tejidos.
- Deje las muestras en hielo durante 10 minutos después de la homogeneización. Centrifugar las muestras a >10.000 x g a 4 °C durante 10 min.
- Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo en hielo sin alterar el pellet. El sobrenadante es la muestra de proteína. Almacene la proteína extraída a -80 °C o proceda directamente a medir la concentración de proteína.
- Cuantificación y normalización de la concentración de proteínas
- Mida la concentración de proteínas mediante un ensayo de ácido bicinconínico (BCA). Prepare una mezcla de ensayo de BCA de acuerdo con las instrucciones del fabricante en una placa óptica de 96 pocillos utilizando 200 μL de mezcla de BCA por pocillo.
nota: Otros métodos de cuantificación, como los ensayos de Lowry y Bradford, también se pueden utilizar para determinar la concentración de proteínas, siempre y cuando la concentración de proteínas se cuantifique de forma coherente en todos los experimentos.
- Preparar patrones de albúmina sérica bovina (BSA) a concentraciones crecientes por triplicado y añadir 1 μL de cada muestra de proteína por duplicado. Incube la placa de 96 pocillos en un bloque de calor precalentado a 60 °C durante 10 minutos o más si se espera que la concentración de proteínas sea baja.
- Después de la incubación, mida la absorción a 560 nm con un lector de placas.
- Exporte las mediciones del lector de placas y calcule la concentración de proteínas comparando los valores medios de absorbancia de cada muestra con una curva estándar obtenida utilizando el patrón de proteínas. El valor de R cuadrado para la curva estándar debe ser mayor o igual a 0,98 para estimar con precisión la concentración de proteínas de la muestra.
- Normalice la cantidad de proteína preparando diluciones de muestras de proteína en tampón de muestra y agua ultrapura. El volumen total se puede ajustar en función del tipo de gel utilizado. Se recomienda cargar 30 μg de proteína por carril como cantidad inicial. Añada un agente reductor como ditiotreitol (DTT; concentración final 5 mM) o beta-mercaptoetanol (concentración final 200 mM) a cada muestra, según sea necesario. Pipetea beta-mercaptoetanol sin diluir en una campana extractora.
- Incubar las muestras en un bloque de calor a 70 °C durante 10 min. Coloque las muestras en hielo, vórtice y gire brevemente para recogerlas. Mantener en hielo hasta que se cargue el gel.
2. Electroforesis en gel de muestras de proteínas
- Configuración del dispositivo y el gel
- Coloque un gel prefabricado con un gradiente de Bis-Tris del 4-12% (consulte la tabla de materiales) en el sistema de cámara de electroforesis en gel. Enjuague los geles con agua bidestilada antes de usar.
NOTA: Dependiendo del tamaño, las interacciones y la abundancia de la proteína de interés, se pueden usar geles con un gradiente diferente, un agente amortiguador o un tamaño y número de pocillos.
- Agregue 500 mL de 1x tampón de funcionamiento MES SDS diluido en agua bidestilada por tanque. Retire con cuidado el peine de los geles después de agregar el tampón de funcionamiento sin alterar los pocillos del gel de apilamiento.
- Carga de proteínas
- Cargue 3,5 μL de un patrón de proteína en el pocillo. Dependiendo del diseño de la muestra, la carga de una escalera de proteínas a ambos lados del gel puede ayudar a estimar con mayor precisión el tamaño de la proteína. Utilice puntas de carga de gel de punta fina para una carga de muestras más precisa.
- Cuando se utiliza un estándar interno para la normalización entre membranas (consulte el paso 5 a continuación y la discusión), cargue una cantidad que sea igual a las otras muestras en los primeros 3 pocillos junto a la escalera de proteínas.
- Cargue 30 μg de cada muestra en los pocillos restantes. Agregue 1x tampón de muestra a todos los pocillos vacíos.
- electroforesis
- Ensamble el tanque de gel después de cargar las muestras. Pase las muestras a través del gel de apilamiento a 80 V durante 10 minutos, seguido de 150 V durante 45-60 minutos adicionales.
3. Transferencia de proteínas
NOTA: La transferencia de proteínas en este protocolo se realiza utilizando un sistema de transferencia semiseco disponible en el mercado (ver Tabla de Materiales) para obtener resultados rápidos y consistentes.
- Prepare la transferencia de proteínas remojando previamente el papel de filtro en agua bidestilada y asegurándose de que el cuchillo de gel, la pipeta Pasteur de plástico, el rodillo secante y las pinzas estén listos para usar.
- Abra la pila de transferencia retirando con cuidado todo el papel de aluminio. Retire la parte superior de la pila inferior y déjela a un lado. Humedezca rápidamente la membrana en la pila inferior con varias gotas de tampón de electroforesis (2-3 mL). Una vez que la pila de transferencia está abierta, es importante evitar que la membrana de PVDF se seque.
- Después de detener la electroforesis, abra el gel prefabricado con el cuchillo de gel y corte el gel de apilamiento. Corta el gel alrededor de sus bordes para liberarlo del molde de plástico. Mantenga el cuchillo de gel húmedo para evitar daños al gel.
- Ensamble la pila de transferencia de abajo hacia arriba: pila inferior (que contiene la membrana de PVDF), gel de proteínas y papel de filtro. Utilice el rodillo secante para eliminar todas las burbujas de aire. Coloque la pila superior encima del papel de filtro y vuelva a enrollar la pila para eliminar las burbujas de aire. No empuje demasiado fuerte, ya que esto puede hacer que el gel se deforme durante la transferencia de proteínas.
- Transfiera toda la pila al dispositivo de transferencia con el electrodo en el lado izquierdo del dispositivo y coloque la esponja de gel encima de la pila para que quede alineada con los contactos eléctricos correspondientes del dispositivo. Cierre la tapa, seleccione e inicie el programa adecuado (20 V durante 7 minutos es un punto de inicio recomendado).
- Cuando termine, deje la tapa cerrada durante 2 minutos para permitir que la pila se enfríe y evitar que la membrana se seque. Retire la pila de transferencia y corte la membrana al tamaño del gel. Lave la membrana cortada rápidamente con agua destilada doble antes de continuar con la mancha de proteína total.
4. Tinción de proteínas totales
>NOTA: El uso de la detección fluorescente proporciona un beneficio sustancial sobre los enfoques más tradicionales (por ejemplo, la detección ECL), ya que el rango lineal y la sensibilidad se pueden controlar mucho mejor. Por lo tanto, en los pasos 4 y 5, se utilizan TPS fluorescentes y anticuerpos secundarios fluorescentes (ver Tabla de Materiales).
- Enrolle la membrana en un tubo de 50 ml con el lado de la proteína hacia adentro. Debido a la sensibilidad a la luz del TPS fluorescente y los anticuerpos secundarios, todos los pasos posteriores se llevan a cabo en la oscuridad.
- Agregue 5 mL de solución de tinción de proteínas (ver Tabla de Materiales) e incube en un rodillo durante 5 min a temperatura ambiente. Debido a que el TPS y el tampón de lavado contienen metanol, realice estos pasos en una campana extractora.
- Deseche la solución de tinción y lave dos veces rápidamente con los 5 mL de solución de lavado (6,3% de ácido acético en 30% de metanol). Vuelva a colocar el tubo brevemente en el rodillo entre los pasos de lavado. Enjuague la membrana brevemente con agua ultrapura antes de continuar.
5. Bloqueo, incubación de anticuerpos y detección
- Bloqueo de la membrana: Agregue 3 mL de tampón de bloqueo (ver Tabla de Materiales) al tubo de 50 mL que contiene la membrana. Incubar la membrana en un rodillo durante 30 minutos a temperatura ambiente. Dependiendo de la elección del anticuerpo, el tipo de tampón de bloqueo utilizado puede requerir optimización.
- Incubación primaria de anticuerpos
- Deseche el tampón de bloqueo y reemplácelo con el anticuerpo primario a la concentración adecuada y optimizada (Figura 1 y Figura 2: ratón-anti-SMN, a 1:1.000, diluido en tampón de bloqueo)
nota: La optimización adecuada de los anticuerpos primarios debe incluir la confirmación de que el anticuerpo detecta un producto proteico del tamaño adecuado mientras muestra una unión mínima o nula a otros productos proteicos inespecíficos. Si es posible, pruebe y compare múltiples anticuerpos contra la proteína de interés.
- Incubar la membrana en un rodillo durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, retire la solución de anticuerpos y lávela 6 veces durante 5 minutos con 1x PBS en un rodillo a temperatura ambiente (RT).
- Incubación secundaria de anticuerpos
- Prepare el anticuerpo secundario específico a 1:5.000 contra el huésped del anticuerpo primario en un tampón de bloqueo de 5 mL. Otros anticuerpos secundarios pueden requerir otras diluciones o el uso de tampones bloqueantes alternativos.
- Incubar la membrana con la solución de anticuerpo secundario en un rodillo durante 1 h a RT. Después de la incubación, lave la membrana tres veces y 30 minutos con 1x PBS en un rodillo.
- Seque la membrana y manténgala protegida de la luz con papel de aluminio hasta su detección. Las membranas se pueden mantener a 4 °C para su almacenamiento a largo plazo.
- Adquisición de imágenes
- Inicie sesión en la computadora conectada al escáner. Coloque la membrana en el escáner con el lado de la proteína hacia abajo y seleccione el área de escaneo en el software.
- Optimice la intensidad del láser para ambos canales (700 nm y 800 nm), confirmando que no se produce saturación. Adquiera las imágenes en ambos canales y exporte las imágenes para su posterior análisis (paso 6).
6. Análisis y cuantificación de Western blot
>NOTA: Estas recomendaciones se basan en el software Image Studio, disponible gratuitamente. Sin embargo, también se pueden realizar análisis comparables utilizando otros paquetes de software, como ImageJ.
- Importar el archivo: cree un espacio de trabajo local en el equipo utilizado para el análisis. Esto genera una base de datos de archivos de imagen para los Western blots adquiridos. Importe los archivos obtenidos en el escáner y seleccione la imagen para su análisis.
- Análisis de TPS
- Visualice el canal de 700 nm para mostrar el resultado total de la tinción de proteínas. En la Figura 1 se incluye un ejemplo de una imagen de TPS en la que se comparan directamente diferentes tejidos de ratones neonatos (P5) (Figura 1A-B) y de 10 semanas de edad (Figura 1C-D). De manera similar, la Figura 2 muestra un ejemplo de una comparación directa de tejido cerebral de ratones de diferentes edades.
- Seleccione la pestaña Análisis en la esquina superior derecha y seleccione Agregar rectángulo para definir el área de interés para la normalización (Figura 1B, D). Copie y pegue la primera área del rectángulo en cada muestra individual para asegurarse de que la región definida tenga el mismo tamaño para todos los carriles analizados.
- Copie el resultado de la pestaña Formas en la esquina inferior izquierda del software.
- Cuantificación
nota: El enfoque óptimo para cuantificar las muestras depende del diseño experimental. Aquí proporcionaremos un ejemplo ilustrativo de la detección de la proteína de supervivencia de la neurona motora (Smn; una proteína clave involucrada en la enfermedad neuromuscular atrofia muscular espinal), que se sabe que disminuye con el tiempo, y cómo la normalización de la intensidad de la señal Smn a TPS proporciona estimaciones confiables del desarrollo de la expresión de proteínas.
- La Figura 2 muestra una disminución de la expresión de Smn con el aumento de la edad del animal con TPS como control de la carga proteica. Repita los pasos 6.2.1-6.2.3 para cuantificar la carga de proteínas (Figura 2B). Repita los pasos 6.2.1-6.2.3 en el canal de 800 nm (Figura 2A) para analizar la proteína de interés.
- Copie los resultados de TPS y la proteína de interés en un programa de hoja de cálculo. En la hoja de cálculo, primero, normalice la carga de proteínas determinando la señal de TPS más alta y dividiendo cada valor de señal de TPS por este valor para obtener el valor de carga de proteínas normalizado.
- Divida el valor de la señal de 800 nm de cada muestra individual por su correspondiente valor de proteína normalizada para calcular la relación relativa de expresión de proteínas en diferentes muestras.
- Después de la primera normalización, compare varios puntos de tiempo o tejidos con el valor promedio del estándar interno para permitir comparaciones directas entre diferentes membranas y experimentos.
