1. Determinación de la composición celular en la suspensión celular mediante el análisis de Western Blot de una sola célula (scWB)
- Rehidrate el chip scWB antes de usarlo en 15 mL de tampón de suspensión 1x en una placa de Petri durante al menos 10 min a RT.
- Agregue 1 mL de la suspensión unicelular diluida (10,000-100,000 celdas/mL) al chip rehidratado. Coloque la superficie en el fondo de una placa de Petri de 10 cm. Asegúrese de que la superficie esté plana.
- Cubra la placa de Petri con una tapa para evitar que se seque y deje que las células se asienten durante 5-15 minutos en un gradiente.
- Coloque el chip bajo un microscopio de campo claro e inspeccione los pocillos con un aumento de 10x.
nota: Aproximadamente el 15-20% de los micropocillos deben estar ocupados por una sola célula, y menos del 2% de los pocillos deben contener 2 o más celdas.
- Incline la placa de Petri de 10 cm que contiene el chip 45 grados.
- Lave el chip con el tampón de suspensión 1x para eliminar las células no capturadas de la superficie del chip mediante un pipeteo suave desde la parte superior hasta la parte inferior del chip. Repite 3 veces.
- Prepare el instrumento occidental de una sola célula.
- Establezca el tiempo de lisis, el tiempo de electroforesis y el tiempo de captura UV. Para analizar los macrófagos reclutados recuperados del tapón de gel derivado de la membrana basal, utilice los siguientes ajustes: tiempo de lisis: 0 s; tiempo de electroforesis: 160 s; Tiempo de captura UV 240 s.
- Cargue con cuidado el chip en la celda de electroforesis del instrumento Western de una sola celda, orientado hacia el lado del gel. Tenga cuidado de no dañar el lado de gel del chip.
- Vierta el tampón de lisis/funcionamiento en la cámara y cubra completamente todo el chip occidental de una sola celda. Iniciar la lisis celular.
- Ejecute el instrumento scWB utilizando la configuración indicada en 1.8.
- Una vez que se complete la ejecución, transfiera el chip a una placa de Petri de 10 cm y lave el chip dos veces con 1x tampón de lavado durante 10 minutos en RT.
- Preparar diluciones de anticuerpo primario (anti-vinculina: 1:10; anti-CD45: 1:15, anti-CD11b: 1:20, anti-F4/80: 1:10) en un volumen total de 80 μL de diluyente de anticuerpo (mezclar 8 μL de anticuerpo 1 más 8 μL de anticuerpo 2 más 64 μL de diluyente).
- Agregue 80 μL de la solución de anticuerpo primario a la cámara de sondeo de anticuerpos y baje el chip con el lado del gel hacia abajo para que la solución de anticuerpos se absorba a través del chip.
- Incubar con la solución de anticuerpo primario durante 2 h a RT.
- Lave la viruta tres veces durante 10 minutos en 1x tampón de lavado en la coctelera.
- Lave el chip una vez durante 10 minutos en el agua de la coctelera para desalar el gel.
- Prepare una dilución 1:20 de anticuerpo secundario en un volumen total de 80 μL (mezcle 2 μL de anticuerpo secundario más 78 μL de diluyente).
- Incubar el chip con un anticuerpo secundario durante 1 h a RT protegido de la luz.
- Lave la viruta tres veces durante 10 minutos con 1x tampón de lavado en la coctelera.
- Gire la viruta con un girador deslizante para eliminar cualquier tampón de lavado restante.
- Escanee el chip en un escáner de microarrays de doble láser con una resolución de 5 μm en el canal espectral del fluoróforo acoplado a los anticuerpos secundarios.
- Analice los datos utilizando software específico de scWB.
2. Pelar el chip scWB
- Guarde el chip escaneado en un tampón de lavado hasta que esté listo para desmontar.
- Coloque el baño de agua en una campana extractora.
- Coloque una gradilla de tubos de 50 ml en el baño de agua con el agua a solo 1 cm por encima de la rejilla y ajuste la temperatura del agua a 60 °C.
- Prepare el búfer de eliminación. Para 1 L de solución tampón de decapante, disuelva 9,85 g de Tris-HCl (pH 6,8) y 20 g de SDS en 900 mL de agua destilada y ajuste el pH. A continuación, llene con agua destilada hasta 1 L. Añada 0,8% (v/v) de β-mercaptoetanol (β-ME; 14,3 M) inmediatamente antes de cada uso.
- Después de la exploración inicial, coloque el chip en una placa de Petri de 10 cm antes de pelarlo.
- Para cada chip, tome 40 mL de tampón de extracción y agregue 320 μl de β-ME.
PRECAUCIÓN: β-ME es tóxico y peligroso para los seres humanos y el medio ambiente. El siguiente procedimiento debe realizarse en una campana extractora.
- Coloque el chip en el recipiente y selle el recipiente con parafilm para evitar que el agua se filtre en el recipiente
- Coloque el recipiente dentro de la rejilla de tubos en el baño de agua precalentado.
- Incubar durante 90 min.
- Retire con cuidado el chip del recipiente y colóquelo en una placa de Petri nueva.
- Lave brevemente el chip una vez con 1x tampón de lavado. A continuación, añada 15 ml de tampón de lavado 1x a la placa de Petri.
- Lave la patata frita durante 15 minutos en una coctelera. Repita el paso de lavado cuatro veces.
nota: El chip está listo para el siguiente anticuerpo primario (consulte los pasos 1.12 a 1.21)
