Ensayo de Western Blot quimioluminiscente para el procesamiento de proteínas

Resumen

Fuente: Hillert-Richter, L. K. et al., Medición de la composición del complejo de señalización inductor de la muerte CD95 y procesamiento de la procaspasa-8 en este complejo. J. Vis. Exp. (2021).

Este video describe la transferencia occidental basada en quimioluminiscencia de lisados inmunoprecipitados. La técnica ayuda a determinar el procesamiento y la activación de proteínas. La señal quimioluminiscente detectada es proporcional al nivel de procesamiento de proteínas durante su activación.

Protocolo

experimentos de células T se realizaron de acuerdo con el acuerdo ético 42502-2-1273 Uni MD.

1. Preparando las células para el experimento

NOTA: El número promedio de células para esta inmunoprecipitación es 1 × 10⁷. Las células adherentes deben sembrarse un día antes del experimento para que haya 1 × 10⁷ células el día del experimento.

1. Preparación de las células adherentes para el experimento
   1. Siembre 5-8 × 10⁶ células adherentes en 20 mL de medio (consulte la composición en la Tabla de Materiales) para cada condición en platos de 14,5 cm un día antes de que comience el experimento.
   2. El día del experimento, asegúrese de que las células estén 80-90% confluentes y adheridas a la placa. Deseche el medio y agregue medio fresco a las células adherentes.
2. Preparación de las células de suspensión para el experimento
   1. Coloque cuidadosamente 1 × 10⁷ celdas de suspensión en 10 mL de medio de cultivo (consulte la Tabla de materiales para la composición) por condición en platos de 14,5 cm inmediatamente antes de comenzar el experimento.
   2. Si utiliza células primarias, aísle las células T primarias de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente. Tratar las células T primarias con 1 μg/mL de fitohemaglutinina durante 24 h, seguido de un tratamiento con IL2 de 25 U/mL durante 6 días.
   3. Coloque cuidadosamente 1 × 10⁸ células T primarias en 10 mL de medio de cultivo (consulte la Tabla de materiales para obtener la composición) por condición en platos de 14,5 cm inmediatamente antes >nota: Se recomienda este mayor número de células T primarias, ya que estas células son más pequeñas.

2. Estimulación CD95L

1. Estimular las células con CD95L (producido como se describió anteriormente o disponible comercialmente (ver la Tabla de Materiales).
   nota: La concentración de CD95L y el tiempo de estimulación dependen del tipo de célula. Prepare una condición de estimulación dos veces para generar una muestra de "control de perlas" en paralelo.
   1. Estimula las células adherentes con la concentración seleccionada de CD95L. Sostenga la placa en ángulo y pipetee el ligando en el medio sin tocar las células adheridas.
   2. Estimule las células en suspensión con CD95L pipeteando la solución del ligando en la suspensión celular.

3. Recolección y lisis celular

1. Coloque los platos de celda en hielo.
   nota: No deseche el medio. Las células moribundas flotan en el medio y son importantes para el análisis.
2. Agregue 10 mL de solución salina fría tamponada con fosfato (PBS) a la suspensión celular y raspe las células adheridas de la placa. Recoja la suspensión celular en un tubo de 50 mL.
3. Lave el plato de la celda con 10 mL de PBS frío dos veces y coloque la solución de lavado en el mismo tubo de 50 mL. Centrifugar la suspensión celular a 500 × g durante 5 min, 4 °C.
4. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular con 1 mL de PBS frío. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 1,5 mL.
5. Centrifugar la suspensión celular a 500 × g durante 5 min, 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular con 1 mL de PBS frío.
6. Centrifugar la suspensión celular a 500 × g durante 5 min, 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular con 1 mL de tampón de lisis (que contiene un cóctel de inhibidores de proteasa al 4%). Incubarlo durante 30 min en hielo.
7. Centrifugar el lisado a velocidad máxima (~17.000 × g) durante 15 min, 4 °C.
8. Transfiera el sobrenadante (lisado) a un tubo limpio. Deseche la bolita. Tome 50 μL del lisado en otro tubo. Analice la concentración de proteína mediante el ensayo de Bradford y tome la cantidad de lisado correspondiente a 25 μg de proteína en un vial. Añada tampón de carga (consulte la tabla de materiales para ver la composición) al vial. Almacenarlo a -20 °C como control de lisado.

4. Inmunoprecipitación (IP)

1. Añada 2 μL de anticuerpos anti-APO-1 y 10 μL de perlas de proteína A sefarosa (preparadas según lo recomendado por el fabricante) al lisado. Agregue solo 10 μL de las perlas a un tubo separado que contenga lisado (muestra estimulada) para generar un 'control de perlas'
   nota: Utilice puntas de pipeta con orificios anchos, ya sea cortando las puntas o comprando puntas especiales para IP mientras manipula las perlas de proteína A sefaros.
2. Incubar la mezcla de lisado con anticuerpos/perlas de proteína A sefarosa con una mezcla suave durante la noche a 4 °C. Centrifugar los lisados con anticuerpos/perlas de proteína A sefarosa a 500 × g durante 4 min, 4 °C. Deseche el sobrenadante, agregue 1 mL de PBS frío a las perlas y repita este paso al menos tres veces.
3. Deseche el sobrenadante. Aspire las perlas preferiblemente con una jeringa Hamilton de 50 μL.

5. Western blot

1. Añadir 20 μL de tampón de carga 4x (ver la Tabla de Materiales para la composición) a las perlas y calentar a 95 °C durante 10 min. Calentar los controles de lisado a 95 °C durante 5 min.
2. Cargue los lisados, los IP y un patrón de proteína en un gel de dodecil sulfato de sodio (SDS) al 12,5% (consulte la Tabla de materiales para la preparación del gel) y haga funcionar con un voltaje constante de 80 V.
3. Transfiera las proteínas del gel SDS a una membrana de nitrocelulosa.
   nota: En este caso, se utilizó la técnica semiseca, optimizada para las proteínas de interés, para la transferencia a lo largo de 12 min (25 V; 2,5 A= constante). Remoje la membrana de nitrocelulosa y dos pilas de transferencia de tamaño mini en tampón de electroforesis (consulte la Tabla de materiales para conocer la composición, prepare de acuerdo con las instrucciones del fabricante) durante unos minutos antes de la transferencia occidental.
4. Coloque la membrana seca en una caja y bloquéela durante 1 h en una solución de bloqueo (0,1% Tween-20 en PBS (PBST) + 5% leche). Incubar la membrana con la solución de bloqueo bajo agitación suave.
5. Lave la membrana tres veces con PBST durante 5 minutos en cada lavado.

6. Detección de Western blot

1. Añadir el primer anticuerpo primario a la dilución indicada (ver Tabla de Materiales) a la membrana e incubar durante la noche a 4 °C con una agitación suave.
2. Lave la membrana tres veces con PBST durante 5 minutos en cada lavado.
3. Incubar la membrana con 20 mL de anticuerpo secundario (diluido 1:10.000 en PBST + 5% de leche) con una agitación suave durante 1 h a temperatura ambiente.
4. Lave la membrana tres veces con PBST durante 5 minutos en cada lavado.
5. Deseche el PBST y agregue aproximadamente 1 mL de sustrato de peroxidasa de rábano picante a la membrana.
6. Detectar la señal quimioluminiscente (ver Tabla de Materiales).
   nota: El tiempo de exposición y el número de imágenes capturadas dependen de la cantidad de proteína en la célula y de la especificidad de los anticuerpos utilizados. Debe establecerse empíricamente para cada anticuerpo utilizado para la detección.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Gel SDS al 12,5%	casero		Para dos geles separadores: 3,28 mL de H2O destilado 2,5 mL de Tris; pH 8,8; 1,5 M 4,06 mL de acrilamida 100 μL 10% SDS 100 μL 10% APS 7,5 μL TEMED para dos geles colectores: 3,1 mL de H2O destilado 1,25 mL de Tris; pH 6,8; 1,5 M 0,5 mL de acrilamida 50 μL 10% SDS 25 μL 10% APS 7,5 μL TEMED
Platos de celda de 14,5 cm	Greiner	639160
acrilamida	Carl Roth	A124.1
Puntas de pipeta con filtro de alta recuperación y orificio ancho	VWR	46620-664 (América del Norte) o 732-0559 (Europa)	Se utiliza para pipetear perlas al lisado
Se utiliza para pipetear perlas al lisado	Sigma Aldrich	A2103	Dilución: 1:4000 en PBST + 1:100 NaN3
anti-APO-1 Ab	Proporcionado en estos experimentos por el Prof. P. Krammer o puede ser comprado por ENZO	ALX-805-038-C100	Se utiliza solo para la inmunoprecipitación
anti-caspasa-10 Ab	Biozol	MBL-M059-3	Dilución: 1:1000 en PBST + 1:100 NaN3
anti-caspasa-3 Ab	Señalización celular	9662 S	Dilución: 1:2000 en PBST + 1:100 NaN3
anti-caspasa-8 Ab C15	Proporcionado en estos experimentos por el Prof. P. Krammer o puede ser comprado por ENZO	ALX-804-242-C100	Dilución: 1:20 en PBST + 1:100 NaN3
anti-CD95 Ab	Santa Cruz	SC-715	Dilución: 1:2000 en PBST + 1:100 NaN3
anti-c-FLIP NF6 Ab	Proporcionado en estos experimentos por el Prof. P. Krammer o puede ser comprado por ENZO	ALX-804-961-0100	Dilución: 1:10 en PBST + 1:100 NaN3
anti-FADD 1C4 Ab	Proporcionado en estos experimentos por el Prof. P. Krammer o puede ser comprado por ENZO	ADI-AAM-212-E	Dilución: 1:10 en PBST + 1:100 NaN3
anti-PARP Ab	Señalización celular	9542	Dilución: 1:1000 en PBST + 1:100 NaN3
Aps	Carl Roth	9592.3
β-mercaptoetanol	Carl Roth	4227.2
Bradford solution Protein Assay Colorante Reactivo Concentrado 450ml	Bio Rad	500-0006	Utilizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante
CD95L	Proporcionado en estos experimentos por el Prof. P. Krammer o puede ser comprado por ENZO	ALX-522-020-C005
detector de quimioluminiscencia Chem Doc XRS+	Bio Rad
Cóctel completo de inhibidores de proteasa (PIC)	Sigma Aldrich	ALX-522-020-C005	Preparado de acuerdo con las instrucciones del fabricante
DPBS (10x) sin Ca, Mg	PAN Biotecnología	P04-53500	Dilución 1:10 con H2O, almacenamiento en la nevera
Tampón de electroforesis	casero		10x tampón de electroforesis: 60,6 g Tris 288 g glicina 20 g SDS ad 2 L H2O dilución 1:10 antes de su uso
glicina	Carl Roth	3908.3
Cabra Anti-Ratón IgG1 HRP	SouthernBiotech	Artículo 1070-05	Dilución 1:10.000 en PBST + 5% de leche
Cabra Anti-Ratón IgG2b HRP	SouthernBiotech	Artículo 1090-05	Dilución 1:10.000 en PBST + 5% de leche
Cabra Anti-Conejo IgG-HRP	SouthernBiotech	4030-05	Dilución 1:10.000 en PBST + 5% de leche
Interleucina-2 humana (hIL-2)	Merckgroup/ Roche	11011456001	Para la activación de las células T
Kcl	Carl Roth	Artículo 6781.2
KH2PO4	Carl Roth	Artículo 3904.1
Tampón de carga 4x Tampón de muestra Laemmli, 10 mL	Bio Rad	Llame al 161-0747	Preparado de acuerdo con las instrucciones del fabricante
Sustrato Luminata Forte Western HRP	Millipore	WBLUFO500
Tampón de lisis	casero		13,3 mL de Tris-HCl; pH 7,4; 1,5 M 27,5 mL de NaCl; 5 M 10 mL de EDTA; 2 mM 100 mL de Triton X-100 añadir 960 mL de H2O
Medio para células adherentes DMEM F12 (1:1) con glutamina estable, 2.438 g/L	PAN Biotecnología	P04-41154	Añadiendo un 10% de FCS, un 1% de penicilina-estreptomicina y un 0,0001% de puromicina al medio
Medio para linfocitos T primarios	gibco por Life Technologie	21875034	Adición de 10% de FCS y 1% de penicilina-estreptomicina al medio
Leche en polvo	Carl Roth	T145.4
Na2HPO4	Carl Roth	P030.3
NaCl	Carl Roth	3957.2
PBST (en inglés)	casero		20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56,8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 Copyright © 2021 JoVE Journal of Visualized Experiments jove.com Página 3 de 3 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O dilución 1:20 antes de usar
PBST + 5% de leche	casero		50 g de leche en polvo + 1 L de PBST
Pha	Thermo Fisher Scientific	R30852801	Para la activación de las células T
Power Pac HC	Bio Rad
Precision Plus Protein Standard Todo Azul	Bio Rad	161-0373	Usar entre 3-5 μL
Proteína A Sepharose CL-4B perlas	Novodirect/ Th.Geyer	GE 17-0780-01	Perlas de resina de afinidad preparadas según las instrucciones del fabricante
rascador	VWR	734-2602
Sds	Carl Roth	4360.2
sacudidor	Heidolph
Azida de sodio	Carl Roth	K305.1
TEMED	Carl Roth	Artículo 2367.3
Pilas de transferencia Trans Blot Turbo de tamaño mini	Bio Rad	170-4270	Utilizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante
Búfer de transferencia TransBlot Turbo 5x	Bio Rad	10026938	Preparado de acuerdo con las instrucciones del fabricante
TransBlot Turbo Membrana de nictrocelulosa de tamaño mini	Bio Rad	170-4270	Utilizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante
Trans-Blot-Turbo	Bio Rad
Tris	Soluto químico	8,08,51,000
Tritón X-100	Carl Roth	3051.4
Preadolescente-20	Pan Reac Appli Chem	A4974,1000