Northern Blot para detectar y cuantificar microARN específicos en el extracto de ARN total de tejido vegetal

Resumen

Fuente: Tirumalai, V., et al. Análisis de transferencia de ARN para la detección y cuantificación de microARN vegetales. J. Vis. Exp. (2020)

En este video, demostramos el northern blot, una técnica de hibridación para detectar y cuantificar microRNAs (miRNAs) a partir de ARN total extraído de tejido vegetal.

Protocolo

1. Electroforesis en gel

1. Detenga la pre-ejecución y lave los pocillos antes de cargar la muestra.
2. Calentar las muestras a 98 °C durante 1 min y cargar las muestras calientes en el pocillo utilizando puntas capilares. Inserte la punta en el fondo del pocillo de modo que la muestra ocupe una capa delgada en el pocillo.
3. Carga completa de todas las muestras. Incluye la carga del marcador de década de ARN.
4. Ejecute el gel a 80 V hasta que el tinte azul de bromofenol se corra casi por completo. El azul de bromofenol funciona a 10 pb en un gel de acrilamida desnaturalizante al 15%.

2. Preparación para ....

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Solución de acrilamida-bisacrilamida al 40%	sigma	A9926	químico
Persulfato de amonio (APS)	BioRad	1610700	químico
Papel secante	Papel secante Whatman I	De 1001 a 125	Ensayo
Azul de bromofenol	sigma	B5525-5G	químico
Puntas de carga capilar	BioRad	2239915	Artículos de plástico
Formamida desionizada	Ambiente	AM9342	químico
Bloque calefactor	Eppendorf	5350	dispositivo
Membrana Hybond N+nylon	Ge	RPN203B	Ensayo
Botella de hibridación	sigma	Z374792-1EA	Artículos de plástico
Horno de hibridación	Termo Científico	1211V79	dispositivo
N,N,N',N'- Tetrametiletilendiamina (TEMED)	sigma	T7024-25ml	químico
PhosphorImager (Generador de imágenes de fósforo)	GE- Escáner Typhoon	29187194	dispositivo
Pantalla y casete PhosphorImager	GE Cuidado de la salud	GE28-9564-75	dispositivo
Pipetas	Gilson, modelos: P20 y P10	FA10002M, FA10003M	Artículos de plástico
Pipeta de plástico	halcón	357550	Artículos de plástico
Aparato de gel de poliacrilamida	BioRad	1658003EDU	dispositivo
Columna Sephadex G-25	GE Cuidado de la salud	27532501	dispositivo
Concentrador Speed Vac	Termo Científico	20-548-130	dispositivo
Spinwin	Tarsons	Año 1010	dispositivo
Polinucleótido quinasa T4 (PNK)	Neb	M0201S	Ensayo
Aparato transblot	BioRad	1703946	dispositivo
Tampón de hibridación ULTRAHyb	Ambiente	AM8670	Ensayo
urea	Fischer Científico	Año 15985	químico
Reticulante UV	UVP	CL-1000L	dispositivo
vórtice	Tarsons	3020	dispositivo
Baño de agua	NEOLAB	D-8810	dispositivo
Xileno cianol	sigma	X4126-10G	Ensayo