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NOTA: Las proteínas recombinantes utilizadas en este estudio, Hsp90 y Cdc37, se obtuvieron comercialmente (ver Tabla de Materiales).
1. Activación del chip
NOTA: Todos los materiales que se utilizarán en el experimento se enumeran en la Tabla de Materiales. Filtre todas las soluciones preparadas a través de un filtro estéril de 0,2 μm.
- Prepare la solución de 1-etil-3-(3-dimetilamino propilo) carbodiimida (EDC) añadiendo 2 mg de EDC a 2,5 mL de tampón 1 M de ácido etano sulfónico (MES) 2-(N-morfolino) (pH = 6,0) en un tubo de 15 mL. Prepare soluciones de N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-NHS) añadiendo 6 mg de sulfo-NHS a 2,5 mL de tampón MES 1 M (pH = 6,0) en un tubo separado de 15 mL. Alícuota 50 μL de cada solución en tubos independientes y almacene a -20 °C para uso futuro.
- Mezcle volúmenes iguales de EDC y solución de sulfo-NHS (50 μL de EDC + 50 μL de sulfo-NHS) pipeteando hacia arriba y hacia abajo (no en vórtice).
NOTA: La solución mezclada de EDC/sulfo-NHS debe usarse dentro de los 30 minutos para mantener una reticulación efectiva para la funcionalización adecuada del chip.
- Coloque el chip biosensor (5,7 cm x 2,4 cm; ver Tabla de Materiales) suministrado por la empresa en una placa de Petri de vidrio con tapa ajustada. Se sugiere que todos los pasos de funcionalización involucrados en la activación del chip se realicen dentro de la placa de Petri. Aplique 50 μL de tampón MES 1 M (pH = 6,0) al chip del biosensor, incube durante 1 min a temperatura ambiente y, a continuación, aspire el tampón.
- Aplique 50 μL de solución de EDC/sulfo-NHS inmediatamente al chip sensor. Cubra la placa de Petri e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. Aspire la solución de EDC/sulfo-NHS del chip.
- Enjuague el chip una vez con 50 μL de tampón MES 1 M (pH = 6,0); aspire el tampón MES.
2. Inmovilización de proteínas diana
- Enjuague el chip 2 veces con 50 μL de 1x PBS (pH = 7,4). Aspire el PBS del chip y agregue la molécula objetivo, Hsp90 (50 μL; 500 nM).
NOTA: La falta de coincidencia del búfer puede arruinar todo el experimento; por lo tanto, antes del experimento, es importante asegurarse de que la molécula objetivo esté en el mismo tampón que el utilizado para la calibración (por ejemplo, 1x PBS (pH = 7,4)). Si es necesario, realice un intercambio de tampones mediante diálisis nocturna antes del experimento. En este experimento, se realizó diálisis nocturna para ambas proteínas recombinantes, Hsp90 y Cdc37, frente a 1x PBS (pH = 7,4; ver Tabla de Materiales) con un intercambio de tampón adecuado a 4 °C. La concentración del material objetivo (Hsp90 en este caso) puede variar en función de los diferentes protocolos experimentales y de la naturaleza de los materiales objetivo (proteína/péptido/ligandos).
- Cubra la placa de Petri de vidrio e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente. Aspirar la solución que contiene la molécula objetivo y enjuagar 3 veces con 50 μL de 1x PBS (pH = 7,4). Aspire la solución 1x PBS (pH = 7,4) del chip.
- Añada 50 μL de solución Quench 1 (3,9 mM de amino-PEG5-alcohol en 1x PBS (pH = 7,4)) al chip. Cubra la placa de Petri de vidrio e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. Aspire la solución Quench 1 del chip.
- Agregue 50 μL de solución de etanolamina Quench 2 (1 M (pH = 8,5)) al chip. Cubra la placa de Petri de vidrio e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. Aspire la solución de Quench 2 del chip y enjuague el chip 5 veces con 50 μL de 1x PBS, dejando la última gota de PBS en el sensor.
3. Preparación de muestras de analito
- Prepare una serie de dilución de analito para Cdc37 en el rango de concentración deseado. Para el primer experimento se utilizaron las siguientes concentraciones: 25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM, 1.000 nM, 2.000 nM, 3.000 nM y 5.000 nM. Para el segundo experimento, se utilizó un conjunto diferente de concentraciones que oscilaban entre 0,4 nM y 200 nM.
- Diseñe el experimento para incluir al menos ocho concentraciones de analito diferentes para obtener un valor de KD confiable. Preparar las diferentes diluciones de la proteína del analito en el mismo tampón que el utilizado para la calibración y la proteína objetivo; aquí es 1x PBS (pH = 7.4).
4. Carga del chip biosensor activado en el dispositivo FEB
NOTA: El dispositivo FEB consta de un lector con indicaciones luminosas LED y un cartucho para insertar el chip del biosensor.
- Después de la inmovilización de la proteína objetivo, inserte el chip activado en el cartucho del dispositivo, que está conectado a través de USB a una computadora. Después de la inserción del chip, se mostrará una luz LED verde en el lector que indica que el dispositivo FEB está listo para el experimento. Instale el software automatizado (ver Tabla de Materiales) suministrado por la empresa en la computadora, a la que está conectado el dispositivo FEB, para monitorear el experimento paso a paso como se describe a continuación.
5. Ejecutar el experimento
- Presione el módulo Ejecutar experimento en el software automatizado y elija 10 puntos con regeneración o cualquier otro protocolo deseado. Rellene los siguientes datos: nombre del operador, nombre del experimento, fecha (por ejemplo, Yana, Hsp90 + Cdc37, 14.03.2021); tampón de regeneración (por ejemplo, tampón PBS); el objetivo inmovilizado (p. ej., Hsp90); analito en solución (p. ej., Cdc37).
- Presione el botón Comenzar el experimento que se muestra en el software y siga las instrucciones que muestra el software automatizado como se describe a continuación><.
nota: El software está totalmente automatizado, es fácil de usar y guía al usuario a lo largo del experimento paso a paso. Aparecerá una ventana emergente en la pantalla con instrucciones para continuar en cada paso del experimento. El software proporcionará instrucciones para cada paso repetitivo de forma consecutiva desde la calibración, la asociación de analitos, la disociación, la regeneración y el lavado (5x) para cada concentración de analito a lo largo del experimento.
- Realizar la calibración del instrumento. Para ello, aspire la solución de PBS restante del chip y aplique 50 μL de tampón de calibración (1x PBS; pH = 7,4). Presione el botón Continuar y espere 5 minutos hasta que finalice el paso de calibración. El software muestra el punto final determinado para el paso de calibración (5 min) con una alarma de advertencia para hacer un seguimiento.
- A continuación, realice una asociación de analitos. Para ello, aspire el tampón de calibración del chip y aplique 50 μL de la concentración de analito más baja (25 nM de Cdc37). Presione el botón Continuar y espere 5 minutos hasta que finalice el paso de asociación. El software muestra el punto final para el paso de asociación (5 min) con una alarma de advertencia para continuar.
- Realizar una disociación del analito. Para ello, aspire la solución de analito del chip y aplique 50 μL del tampón de disociación (1x PBS; pH = 7,4). Presione el botón Continuar y espere 5 minutos hasta que finalice la duración del paso de disociación (5 minutos). El software muestra el punto final para el paso de disociación (5 min) con una alarma de advertencia para hacer un seguimiento.
- A continuación, realice la regeneración del chip. Aspirar la solución de disociación del chip y aplicar 50 μL de tampón de regeneración (1x PBS; pH = 7,4). Presione el botón Continuar y espere 30 s hasta que finalice la duración del paso de regeneración (30 s). El software muestra el punto final para la etapa de regeneración (30 s) con una alarma de advertencia para realizar un seguimiento.
- Por último, lava la patata frita. Aspire la solución de regeneración de la viruta y aplique 50 μL de tampón de lavado (1x PBS; pH = 7,4) a la viruta. Aspire la solución del chip y repita esto 5 veces. Deje la última gota de tampón de lavado en el chip y presione el botón Continuar y espere 30 s hasta que finalice la duración del paso de lavado en la pantalla del software><.
NOTA: El software muestra el punto final para el paso de lavado (30 s) con una alarma de advertencia para continuar con el siguiente ciclo del experimento.
- Repita los pasos para cada concentración de analito utilizada; los cinco pasos de calibración, asociación de analito, disociación, regeneración y lavado (5x) constituyen un ciclo. Para el experimento que se muestra aquí, realizamos 10 ciclos para 10 concentraciones de analito (que van de 25 nM a 5.000 nM o de 0,4 nM a 200 nM; Figura 1).
