Técnicas de detección de interacciones biomoleculares

En este video, describimos la tecnología de biodetección de efecto de campo (FEB) para detectar y cuantificar las interacciones proteína-proteína. Las proteínas diana inmovilizadas en el biosensor de grafeno interactúan con las proteínas del analito en solución, lo que provoca alteraciones de la corriente eléctrica en el sistema FEB. Este cambio en la respuesta eléctrica indica la afinidad de unión entre las proteínas.

En este video, demostramos el uso de la fotometría masiva para estudiar las interacciones antígeno-anticuerpo en una cámara de flujo. La luz enfocada se dispersa de manera diferente según la masa de las moléculas. Un detector recoge la luz dispersa y genera el patrón de interferencia en forma de puntos de intensidades variadas, que se correlacionan con las masas moleculares.

El video describe la técnica de imagen FLIM-FRET para determinar la interacción proteína-proteína en bacterias vivas que expresan proteínas citoplasmáticas marcadas con proteínas fluorescentes, un eGFP donante y mCherry aceptor. La técnica combinada también permite la cuantificación de las proteínas que interactúan.

En este video, demostramos la técnica para medir las interacciones transcelulares entre las moléculas de adhesión de células sinápticas a través del ensayo de agregación celular HEK. En este ensayo, un número igual de células HEK que expresan una molécula de adhesión celular presináptica deseada y una proteína fluorescente se mezclan con células HEK que expresan una molécula de adhesión celular postsináptica y otra proteína fluorescente. La interacción entre las moléculas de adhesión celular...

Este video describe el ensayo de ligadura de proximidad para estudiar in situ las interacciones proteína-proteína en células de nematodos. La proximidad de las proteínas de interés genera la plantilla circular de ADN con la ayuda de una sonda de PLA unida a un anticuerpo secundario. La sonda se amplifica aún más utilizando la solución de amplificación, que produce un ADN monocatenario largo seguido de la hibridación de la sonda detectora, lo que permite la localización de las interacciones...

Este video muestra complejos de proteínas co-inmunoprecipitadas en una membrana de PVDF para el análisis de la interacción proteína-proteína. Las proteínas reducidas de los complejos se trataron con tripsina para escindir las proteínas individuales en los péptidos más pequeños, luego, los péptidos restantes se extrajeron de la membrana de PVDF. El péptido extraído derivado de ambas proteínas en el complejo se secó y se resuspendió en una baja concentración de ácido fórmico para su posterior...

En este video, demostramos la tecnología de interferometría de biocapas (BLI) para detectar las interacciones intermoleculares entre ligandos y analitos objetivo en tiempo real. BLI mide los cambios en el patrón de interferencia de la luz blanca reflejada por una capa de ligandos inmovilizados en la superficie de un biosensor a medida que interactúan con los analitos en solución.

Este video demuestra el uso de la espectroscopia de fluctuación de fluorescencia para detectar la interacción entre las proteínas de la superficie celular en los contactos célula-célula. Mediante la expresión del receptor de adhesión transmembrana de interés marcado con una proteína fluorescente y la mezcla de dos poblaciones celulares diferentes que albergan dos etiquetas fluorescentes separadas espectralmente, la transinteracción entre los receptores de dos células vecinas con fluorescencia...

En este video, demostramos una técnica para realizar la co-inmunoprecipitación de proteínas PD-1 mutadas y de tipo salvaje marcadas con GFP utilizando perlas recubiertas con anticuerpos anti-GFP. Las proteínas PD-1-GFP unidas a perlas se incuban con proteínas SHP2 que interactúan con PD-1, lo que permite la identificación de motivos estructurales específicos en PD-1 que desempeñan un papel fundamental en la interacción de SHP2.

Este video describe una técnica basada en ELISA que detecta las interacciones proteína-proteína entre dos proteínas midiendo la unión de la segunda proteína a la primera proteína inmovilizada. La segunda proteína unida se detecta utilizando anticuerpos específicos marcados con una enzima, como la peroxidasa de rábano picante.

Este video muestra un ensayo de biosensor conductimétrico para estudiar la interacción de un anticuerpo con un antígeno objetivo inmovilizado en un chip transductor. El biosensor está diseñado para tener una proteína quimérica bifuncional: una enzima β-lactamasa con un sitio catalítico funcional fusionado a un nanocuerpo para unirse al antígeno objetivo inmovilizado. Al unirse, la hidrólisis catalítica de un sustrato antibiótico por la enzima β-lactamasa genera una señal eléctrica que confirma...

Este video muestra una técnica que utiliza péptidos biotinilados que penetran en las células para detectar interacciones intracelulares proteína-proteína. Los péptidos que penetran en las células facilitan que el péptido conjugado entre en una célula y se una específicamente a sus proteínas que interactúan. La biotina, después de unirse a la avidina, permite la purificación del complejo de proteínas que interactúan a partir de un lisado celular.

Este video muestra el ensayo de dos híbridos de levadura para detectar autointeracciones de proteínas específicas. En este ensayo, la proteína de interés se marca con dos dominios de un factor de transcripción que codifica la enzima β-galactosidasa. Cuando las dos proteínas interactúan, esto hace que la transcripción y la traducción formen la enzima, que luego se detecta mediante un ensayo bioquímico.

Este video muestra la purificación por afinidad en tándem, una técnica para purificar complejos de proteínas de células eucariotas para estudiar la interacción proteína-proteína. El complejo contiene dos proteínas marcadas con diferentes etiquetas de epítopos. Tras la purificación del complejo utilizando dos resinas con afinidad por las dos marcas diferentes de forma secuencial, la presencia de ambas proteínas en el eluido confirma la interacción entre ambas.

Este video describe la técnica de resonancia de plasmón de superficie, o SPR, para estudiar la interacción entre dos moléculas utilizando un chip sensor. El cambio en el ángulo de resonancia y la intensidad de la luz reflejada se detectan en función de la asociación y disociación de dos moléculas, y esto proporciona información sobre las interacciones entre las dos moléculas.

Este video describe la técnica de espectroscopia de resonancia magnética nuclear para estudiar las interacciones proteína-proteína entre 15proteínas envoplakina mutantes y de tipo salvaje marcadas con N y la proteína vimentina no marcada. La interacción exitosa entre la envoplaquina de tipo salvaje y la vimentina conduce a un amplio ensanchamiento de la línea y a la desaparición de picos en los espectros de RMN, mientras que la ausencia de una interacción entre la envoplaquina mutada y la...

En este video, demostramos la técnica de visualización de fagos para aislar fagos prediseñados que expresan proteínas con alta afinidad por la proteína objetivo.

Este video demuestra la técnica de espectroscopia de fluctuación de fluorescencia (FFS) para estudiar la homo-oligomerización de proteínas. Las proteínas marcadas con fluorescencia en una muestra se dimerizan con un agente cuando se estudia la oligomerización de proteínas con FFS. Utilizando un microscopio confocal, a medida que las proteínas entran y salen del pequeño volumen de observación, se realiza el análisis de las fluctuaciones en el brillo de las moléculas fluorescentes para determinar...

Este video describe BiFC-PALM, una combinación de microscopía de localización fotoactivada y complementación de fluorescencia bimolecular, para evaluar las interacciones proteína-proteína. BiFC implica la fusión de dos fragmentos de proteínas fluorescentes con dos proteínas de interés que interactúan. Cuando las dos proteínas interactúan, los fragmentos se acercan, lo que permite que las dos partes se unan y reconstituyan una proteína fluorescente funcional. La fluorescencia de un solo...

En este video, describimos la técnica de anisotropía de fluorescencia para estudiar las interacciones entre la proteína del síndrome de Shwachman-diamond (SBDS) marcada con fluoróforos y la 1 GTPasa similar al factor de elongación (EFL1). En la incubación de proteínas SBDS con concentraciones gradualmente crecientes de EFL1, se observa un aumento constante de la anisotropía, lo que indica una interacción exitosa entre las dos proteínas.

En este video, demostramos la técnica de espectroscopia de resonancia magnética nuclear en célula para estudiar las interacciones proteína-ligando entre proteínas sobreexpresadas no marcadas y moléculas pequeñas. El éxito de la interacción ligando-proteína se confirma visualmente por la aparición de un conjunto adicional de picos en la región espectral de interés que sustituye gradualmente a los picos originales.

Este video muestra un método para estudiar las interacciones proteína-medicamento utilizando el biopaneo basado en biosensores QCM de la biblioteca de péptidos mostrados por el fago T7. El biopaneo de fagos que muestran un péptido específico en el biosensor QCM permite el aislamiento específico de péptidos de alta afinidad, seguido de la secuenciación de aminoácidos, lo que ayuda a identificar sitios de interacción específicos en la proteína objetivo.

Este video describe SEC-MALS, que aprovecha las capacidades de la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) y la dispersión de luz multiángulo (MALS). En SEC-MALS, el SEC separa las proteínas o los complejos de proteínas en función de su tamaño, y el detector MALS determina el peso molecular medio midiendo la intensidad de la luz dispersada por la molécula en diferentes ángulos.

En este vídeo, hemos demostrado la purificación de afinidad por complementación bimolecular, BiCAP, para detectar y aislar dímeros de proteínas específicas utilizando anticuerpos de dominio único específicos de conformación.

En este video, describimos un ensayo de unión competitiva basado en citometría de flujo para detectar las interacciones entre el receptor de quimiocinas CXC 4 (CXCR4) y su ligando natural marcado con fluorescencia CXC Chemokine Ligand 12 (CXCL12), en presencia de una molécula pequeña dirigida a CXCR4. La incubación de células que expresan CXCR4 con concentraciones más bajas de moléculas pequeñas permite la unión de CXCR4-CXCL12 hasta cierto punto, que disminuye progresivamente con un aumento...

Este video muestra la detección de la interacción receptor-ligando basada en el ensayo reportero. La interacción exitosa, receptor-ligando, activa la vía de señalización aguas abajo, lo que provoca la generación y liberación de citocinas como moléculas reporteras secretoras en la solución, lo que se confirma mediante ELISA.

En este video, se utilizan sondas de fuerza de biomembrana (BFP) para medir las fuerzas entre receptores y ligandos. Esta técnica puede detectar interacciones mediante el monitoreo de la presión necesaria para romper los enlaces entre el pMHC conjugado en las perlas de la sonda y los TCR en las celdas objetivo.

Este video muestra un ensayo de competencia para estudiar las proteínas asociadas a la GTPasa. Utilizando la proteína GTPasa unida a nucleótidos inmovilizada en perlas magnéticas, se puede estudiar la unión competitiva entre dos proteínas asociadas que interactúan para el mismo sitio de unión en la GTPasa para evaluar las afinidades de unión de las proteínas asociadas.

En este video, demostramos el proceso para detectar isotipos de anticuerpos en múltiples muestras de suero humano utilizando un portaobjetos de microarray impreso con subtipos antigénicos de cepas del virus de la influenza.

En este video, demostramos el ensayo de cambio de movilidad electroforética para detectar interacciones proteína-ADN utilizando sondas de ADN marcadas con fluorescentes infrarrojos. Cuando la proteína se une a la sonda de ADN, forma un gran complejo que migra lentamente y aparece como una banda desplazada en el gel.

En este video, demostramos la técnica de inmunoprecipitación de cromatina para identificar sitios de unión a proteínas en regiones específicas del ADN genómico de células precursoras de oligodendrocitos a través de la inmunoprecipitación selectiva de fragmentos de cromatina unidos a proteínas. Este método ayuda a estudiar la interacción de varias proteínas reguladoras, incluidos los factores de transcripción implicados en la regulación génica.

Este video describe la anisotropía de fluorescencia de alto rendimiento que ayuda a monitorear la interacción entre los factores de transcripción y el ADN. El ensayo monitorea las interacciones de una molécula de ADN marcada con fluoróforos con su factor de transcripción específico midiendo el grado de polarización debido a la rotación molecular o anisotropía del ADN marcado con fluoróforos.

Este video muestra un ensayo in vivo en bacterias para estudiar la interacción de las proteínas de unión al ARN (RBP) con el ARN. Las células bacterianas se transforman con dos construcciones de plásmidos: un plásmido de sitio de unión que codifica un ARNm que contiene un gen indicador fluorescente aguas abajo de un sitio de unión RBP, mientras que un plásmido RBP expresa las proteínas RBP bajo el control de un inductor. Tras el aumento mediado por inductores en la producción de RBP, los RBP se...

En este video, demostramos el ensayo de un híbrido de levadura modificada, que detecta múltiples proteínas que interactúan con el ADN objetivo. Las células de levadura transformadas contienen la secuencia de ADN diana aguas arriba del gen reportero. Además, expresan proteínas factores de transcripción. Cuando las proteínas forman complejos y se unen al ADN diana, el gen reportero se expresa y puede detectarse enzimáticamente.

En este video, demostramos el procedimiento para determinar la actividad helicasa de una proteína objetivo para desenrollar el sustrato de dsRNA marcado con biotina. La actividad de la enzima se identificó mediante el análisis del cambio de movilidad electroforética, seguido de un ensayo de quimioluminiscencia utilizando estreptavidina conjugada con enzima quimioluminiscente.

En este video, describimos el método de inmunofluorescencia para visualizar la localización de las proteínas de reparación del ADN γH2AX y 53BP1 en los sitios de roturas de ADN de doble cadena en núcleos celulares irradiados.

Este video muestra un ensayo de extracción de ARN in vitro para identificar proteínas de unión a ARN (RBP), que interactúan con las secuencias de elementos ricos en adenilato-uridilato (ARE) en el ARNm. Las RBP diana de un lisado celular se mezclan con una sonda de ARN para formar complejos de ARN-proteína. Los complejos se aíslan mediante purificación por afinidad utilizando la afinidad de la marca de destiobiotina de la sonda de ARN a una perla magnética marcada con estreptavidina.

En este video, describimos la evolución sistemática de ligandos mediante el método de enriquecimiento exponencial (SELEX) para identificar secuencias específicas de unión a ARN para una proteína diana de interés. La proteína se incuba con un gran grupo de secuencias de ARN aleatorias, y las secuencias de ARN de unión a proteínas se aíslan, se amplifican por PCR y se secuencian para identificar sus sitios de unión a proteínas.

Este video describe un método para visualizar el ensamblaje de condensados de proteínas de fusión en moléculas de ADN en loci específicos utilizando imágenes de una sola molécula. Estos condensados se forman debido a las interacciones LCD-LCD y LCD-DBD, que permiten el reclutamiento de ARN polimerasa II y una mejor transcripción de genes.

Este video muestra la calorimetría diferencial de barrido, una técnica para estudiar la interacción entre una biomolécula y un ligando. La unión de un aptámero de ADN y un ligando termolábil se estudia mediante la aplicación de repetidos ciclos de calentamiento y enfriamiento a la muestra y la obtención de escaneos para el análisis termodinámico.

Este video muestra la termoforesis a microescala para estudiar la interacción proteína-lípido. El ensayo detecta la interacción entre moléculas cuantificando el movimiento termoforético de las proteínas marcadas con fluorescencia en respuesta a un gradiente de temperatura. La molécula fluorescente se mezcla con diferentes concentraciones de moléculas lipídicas no fluorescentes, y la mezcla de moléculas en la solución se carga en capilares. Se aplica un gradiente de temperatura a las muestras en...

En este video, demostramos la interacción entre proteínas y vesículas de fosfolípidos artificiales utilizando citometría de flujo cuantitativa. La unión de proteínas marcadas con fluorescencia a vesículas de fosfolípidos marcadas con fluorescencia aumenta la intensidad media de fluorescencia, y este aumento se detecta mediante un citómetro de flujo.

Este video muestra una técnica de microgravimetría disipativa para investigar la unión de proteínas a bicapas lipídicas. Se añaden pequeñas vesículas unilaminares para recubrir la superficie del sensor de cuarzo de una microbalanza. Utilizando la unión dependiente de iones de calcio de la proteína de unión a fosfolípidos objetivo a la bicapa, se monitorean los cambios en la frecuencia de oscilación del sensor y la disipación de la oscilación para determinar la naturaleza de la unión de la...

En este video, demostramos las interacciones proteína-fosfoinositida en un patrón microfluídico utilizando el ensayo de modulación de pH, utilizando un colorante fluorescente sensible al pH marcado con el lípido de fosfatidiletanolamina de una bicapa lipídica soportada, llamada plataforma microfluídica. Las modulaciones en el pH después de la unión de proteínas a fosfolípidos causan extinción de fluorescencia.