1. Preparar las cámaras de flujo
- Limpie los cubreobjetos de vidrio
- Usando botellas de lavado con agua destilada, etanol e isopropanol, enjuague los cubreobjetos de 24 mm x 50 mm en el siguiente orden: agua, etanol, agua, isopropanol, agua. Seque los cubreobjetos con un chorro de nitrógeno limpio. Es importante enjuagar los cubreobjetos de arriba hacia abajo, sujetando la esquina inferior con pinzas de punta suave. Seque el cubreobjetos en la misma dirección para evitar la transferencia de contaminación de las pinzas (Figura 1A).
- Del mismo modo, enjuague los cubreobjetos de 24 mm x 24 mm con agua destilada, etanol y agua destilada. Seque los cubreobjetos con un chorro de nitrógeno limpio.
- Identifique el lado de trabajo del cubreobjetos, coloque una gota de agua destilada en la superficie del cubreobjetos limpio y siga los pasos 3.1 y 3.2 del protocolo. Por lo general, solo un lado del cubreobjetos de 24 mm x 50 mm tiene la calidad óptica adecuada para las mediciones de MP.
nota: Después de enfocar, no se deben detectar imperfecciones significativas en la superficie y el valor de la "señal" que se muestra en el software de recopilación de datos debe ser inferior al 0,05% (Figura 2A-C). Los lados de trabajo de todos los cubreobjetos de la caja están orientados en la misma dirección. Se debe utilizar el mismo procedimiento para probar la eficiencia de la limpieza del cubreobjetos.
- Montar la cámara de flujo
- Coloque el cubreobjetos de 24 mm x 24 mm sobre un trozo de papel de aluminio. Coloque tiras de cinta adhesiva de doble cara encima del cubreobjetos de 24 mm x 24 mm como se muestra en la Figura 1B y corte la cinta a lo largo del borde del vidrio. Separe el cubreobjetos del papel de aluminio y fíjelo al lado de trabajo del cubreobjetos de 24 mm x 50 mm (Figura 1C).
nota: El tamaño del canal puede variar, pero se recomienda un ancho de 3 mm a 5 mm. Los canales más anchos requieren volúmenes de muestra más grandes y los canales muy estrechos pueden ser difíciles de cargar. Por lo general, se pueden crear fácilmente dos canales paralelos en el cubreobjetos de 24 mm x 24 mm. El protocolo se puede pausar aquí.
2. Prepare las muestras de anticuerpo-antígeno para las mediciones de afinidad
- Filtre al menos 2 ml del tampón PBS con filtros de jeringa de 0,22 μm para eliminar las partículas de polvo o los agregados. Centrifugar la reserva de proteínas durante 10 minutos a la velocidad máxima de la centrífuga de mesa (aproximadamente 16.000 x g).
nota: PBS es el tampón recomendado para este protocolo, pero MP no tiene requisitos particulares de tampón, y otros tampones biológicos también son aceptables. Sin embargo, las concentraciones altas de glicerol (>10%) y las resistencias iónicas muy bajas (concentración de sal <10 mM) pueden afectar a la calidad de la imagen y los datos y no se recomiendan.
- Determine las concentraciones reales de las reservas de anticuerpos y antígenos midiendo su absorbancia UV de 280 nm.
- Calcule las concentraciones medidas de la mezcla de antígeno y anticuerpo. Si no se conoce el valor estimado de la afinidad de unión al anticuerpo, planifique preparar una muestra con una concentración de antígeno de 30 nM y 20 nM de anticuerpos. Cuando se conoce la afinidad aproximada, la relación anticuerpo-antígeno y sus concentraciones deben optimizarse de acuerdo con los valores esperados de Kd. Utilice la concentración total de antígeno en la mezcla igual a la suma de la Kd esperada y la concentración total de anticuerpos en la siguiente ecuación. Suponiendo Kd1 = Kd2 para los dos paratopos del anticuerpo, esto dará como resultado concentraciones comparables del anticuerpo libre y de los complejos anticuerpo-antígeno en la muestra><.
Ajuste la concentración de anticuerpos para mantener la concentración total de proteínas en la muestra dentro del rango de 10 nM y 50 nM. Los mejores resultados se obtienen utilizando mezclas con concentraciones de anticuerpos entre 5 nM y 25 nM.
nota: MP detecta proteínas con una masa molecular superior a 40 kDa. En consecuencia, las concentraciones de muestras de antígenos con una masa molecular inferior a 40 kDa pueden superar el límite típico de 50 nM. Sin embargo, a concentraciones superiores a aproximadamente 100 nM, incluso los antígenos de baja masa molecular podrían afectar a la calidad de la imagen y a la precisión de la determinación de Kd.
- Preparar 50 μL de la mezcla de anticuerpo-antígeno en su concentración de medición final calculada en el paso 2.3.
nota: Solo se requiere una muestra de la mezcla de antígeno y anticuerpo para la determinación de Kd. Sin embargo, la preparación de varias muestras con diferentes proporciones de antígeno a anticuerpo puede ayudar a optimizar la concentración de la muestra. Si se recogen datos de varias muestras, se pueden analizar mediante un ajuste global.
- Incubar la(s) mezcla(s) de antígeno-anticuerpo durante aproximadamente 10 minutos a temperatura ambiente para permitir que la reacción de unión alcance el equilibrio químico. Evite tiempos de incubación innecesariamente largos.
nota: El tiempo de incubación puede variar en función de la cinética de unión. Para confirmar que se ha alcanzado el equilibrio químico, las mediciones de la muestra se pueden repetir en diferentes momentos de incubación. Los valores de Kd invariantes en el tiempo indican una incubación suficientemente larga. La incubación prolongada puede conducir a una adsorción significativa de proteínas a la superficie del material de laboratorio de plástico y, en consecuencia, a errores significativos en la determinación de la concentración de proteínas. Por esta razón, se recomienda encarecidamente el uso de material de laboratorio de baja adherencia para la preparación de muestras de MP.
3. Recopilar los datos de Fotometría Masiva
- Aplique una gota de aceite de inmersión para microscopio en el objetivo del instrumento MP y coloque la cámara de flujo ensamblada en la platina del microscopio. Asegúrese de que el aceite abarque el espacio entre el cubreobjetos y el objetivo.
- Cargue la cámara de flujo y enfoque el fotómetro de masa.
- Deposite 10 μL de una solución tampón limpia y filtrada en un extremo del canal de la cámara de flujo preparado en el paso 1. El líquido entrará en el canal por capilaridad.
- Ajuste la posición Z de la platina para enfocar el microscopio en la superficie de trabajo del cubreobjetos de 24 x 50 mm.
- En la pestaña Control de enfoque del software de recopilación de datos, utilice los botones Arriba y Abajo del movimiento grueso de la platina para realizar los ajustes iniciales.
- Haga clic en el botón Nitidez para mostrar la lectura de la señal de nitidez y utilice los botones de ajuste fino Arriba y Abajo para maximizar el valor de Nitidez.
- Haga clic en los botones Establecer enfoque y Bloquear enfoque para activar la función de seguimiento de enfoque. Una imagen correctamente enfocada (Figura 2A, C) debe tener un valor de "señal" inferior al 0,05%.
nota: Si el valor de la "señal" en la posición de nitidez máxima es superior al 0,05%, esto puede indicar impurezas en la superficie del vidrio o en el tampón.
- Usando el mismo canal, cargue 20 μL de la muestra de anticuerpo-antígeno depositándola en un lado del canal y secando el líquido del otro extremo con un pequeño trozo de papel secante (Figura 1D).
nota: El volumen de un canal de 3-5 mm de ancho es de aproximadamente 10 μL. Se recomienda el volumen de muestra adicional para reemplazar completamente el tampón presente en el canal y evitar la dilución de la muestra.
- Después de cargar la muestra, haga clic inmediatamente en el botón Grabar para iniciar la recopilación de datos, adquiriendo un video de 100 s (Figura 2D).
- Al final de la recopilación de datos, introduzca el nombre del archivo y haga clic en Aceptar para guardar el archivo de datos.
- Deseche los cubreobjetos y limpie el aceite de la lente del objetivo con hisopos ópticos de algodón humedecidos con isopropanol.
nota: El protocolo se puede pausar aquí.
4. Analice los datos de MP
- Procese el archivo de video recopilado utilizando el software de procesamiento de datos MP para identificar los eventos de aterrizaje.
- Utilice la opción de menú Archivo/Abrir para cargar el archivo para el análisis y haga clic en Analizar.
- Haga clic en el botón Cargar para cargar la función de calibración y guardar los datos analizados utilizando la opción de menú Archivo/Guardar resultados como.
- Ajuste la distribución de masa molecular con funciones gaussianas para obtener concentraciones relativas de cada especie en la muestra. Este análisis se puede realizar utilizando un software de gráficos científicos común (ver Tabla de Materiales).
- Importe el archivo "eventsFitted.csv" en el software y trace la distribución de la masa molecular (columna M en el archivo .csv) utilizando la función Plot/Statistics/Histograma.
- Haga doble clic en el histograma para abrir la ventana Propiedades de trazado. Deshabilite la agrupación automática y seleccione un tamaño de ubicación de 2,5 kDa. Haga clic en los botones Aplicar y Ir para crear los datos de Centros de ubicación y Recuentos.
- Seleccione las columnas Centros de bin y Recuentos y utilice la función de menú Análisis/Picos y Línea base/Ajuste de picos múltiples para ajustar el histograma con funciones gaussianas. Haga doble clic para indicar las posiciones máximas aproximadas en la gráfica de distribución y, a continuación, haga clic en el botón Abrir NLFit.
- Marque las casillas de verificación Fijo para los centros de pico "xc" y establezca sus valores en las masas moleculares esperadas del anticuerpo libre y los complejos antígeno-anticuerpo simple y doble. Marque la opción Compartir para los parámetros de ancho. Haga clic en el botón Ajustar. Los valores ajustados de altura de pico de los componentes gaussianos representan la concentración relativa de cada especie en la muestra.
nota: El tamaño del contenedor se puede ajustar para optimizar la resolución de la gráfica de distribución de masa. El límite de precisión de MP es de aproximadamente 1 kDa, y los tamaños de bin más pequeños pueden amplificar el ruido de la distribución, sin revelar ninguna información adicional. Los tamaños de contenedor muy grandes oscurecerán los detalles finos de las distribuciones masivas.
- Calcule la fracción de concentración de cada especie utilizando la siguiente ecuación:
donde los valores de hi y fi representan las alturas de los picos y las fracciones de concentración del anticuerpo libre y del anticuerpo unido simple y doble en la muestra, respectivamente.
