1. Preparación de la almohadilla de agarosa (Figura 1)
- Coloque un portaobjetos de vidrio de microscopio sobre una superficie horizontal plana. Coloque dos portaobjetos de vidrio cubiertos con dos capas de cinta adhesiva a cada lado del portaobjetos inicial.
nota: Mantenga un espacio de 1-2 mm entre los tres portaobjetos alineados para evitar que la agarosa derretida se extienda finalmente por los portaobjetos con cinta adhesiva.
- Pipetear y verter una gota de 70 μL de agarosa derretida al 1% en el portaobjetos de vidrio. Agregue un cuarto deslizamiento en la parte superior para aplanar la gota de agarosa y presione suavemente. Espere aproximadamente un minuto.
- Retire el portaobjetos superior y deje caer con una pipeta unos 3 μL de bacterias en 3 o 4 puntos en diferentes lugares sobre la almohadilla de agarosa.
- Cubra con un cubreobjetos de vidrio de microscopía (por ejemplo, un espesor de 22x22 mm #1.5).
nota: La planitud y el grosor de los cubreobjetos son importantes para trabajar con excitaciones de dos fotones. Los cubreobjetos de precisión con planitud uniforme controlada y baja autofluorescencia suelen ser una buena opción.
- Fije el cubreobjetos con parafina derretida para sellar el cubreobjetos en el portaobjetos de vidrio. Comience fijando las cuatro esquinas del cubreobjetos.
2. Imágenes con una configuración de microscopía de dos fotones
NOTA: Estamos utilizando un microscopio invertido de barrido por excitación de dos fotones hecho en casa con un objetivo de inmersión en agua de 60x 1.2NA que funciona en modo de recolección de fluorescencia desescaneado. La longitud de onda de excitación de dos fotones se establece en 930 nm. Es proporcionado por un láser Ti:Sapphire (tasa de repetición de 80 MHz, ≈ ancho de pulso de 70 fs) que trabaja a 10-20 mW. Los fotones de fluorescencia se recogieron a través de un filtro de paso corto de 680 nm y un filtro de paso de banda de 525/50 nm antes de ser dirigidos a un fotodiodo de avalancha acoplado a fibra conectado a un módulo de conteo de fotones individuales correlacionado en el tiempo (TCSPC). El microscopio también está equipado con una lámpara de fluorescencia de transmisión. En la actualidad, hay varios microscopios FLIM-FRET disponibles en el mercado y muchas instalaciones de diagnóstico por imágenes están equipadas con configuraciones capaces de realizar mediciones FLIM-FRET.
- Utilice la lámpara de fluorescencia para enfocar el objetivo en la monocapa de bacterias en la muestra y seleccionar las regiones de interés.
- Compruebe que el obturador del láser de excitación esté cerrado y que la luz infrarroja procedente del láser esté bloqueada y no entre en el microscopio.
cautela: Se debe prestar mucha atención y vigilancia constante al trabajar con láseres pulsados por infrarrojos, ya que la luz del láser no puede ser vista por los ojos, pero cualquier exposición directa o reflexión láser transitoria, puede ser extremadamente dañina y crear daños oculares irreversibles. Consulte los procedimientos de seguridad láser locales y la capacitación antes de usar configuraciones de microscopía.
- Coloque el portaobjetos de microscopía en la platina con los cubreobjetos mirando hacia el objetivo.
- Compruebe que la lámpara de fluorescencia esté encendida.
- Gire la torreta del cubo de filtro para seleccionar el cubo eGFP y abra el obturador de la lámpara de fluorescencia.
- Envíe la luz de fluorescencia hacia el ocular del microscopio.
Precaución: Asegúrese de que se dispongan los filtros adecuados en la trayectoria de la luz para descartar la luz de excitación directa proveniente de la lámpara de fluorescencia que puede dañar los ojos.
- Enfoque el objetivo en las bacterias usando la perilla del microscopio.
- Seleccione una región de interés en la muestra traduciéndola con el joystick que controla la etapa motorizada
nota: El enfoque es más fácil con muestras altamente fluorescentes que permiten ver la fluorescencia directamente con los ojos.
- Cambie la excitación del láser 2PE para las mediciones FLIM-FRET.
- Envíe la trayectoria de emisión de fluorescencia de vuelta hacia el detector.
- Gire hacia atrás la torreta del cubo del filtro para seleccionar el cubo dicroico para el láser de 930 nm.
- Ajuste la potencia del láser a 20 mW.
- Establezca el tamaño de la región de interés en 30 μm. Esta operación ajusta el voltaje que opera los galvo-espejos y define el rango de sus movimientos (Figura 2).
- Encienda el detector y comience a escanear la muestra: los botones de inicio y parada que controlan el escaneo también controlan la apertura y el cierre del obturador láser, tanto por razones de seguridad como para limitar el fotoblanqueo de la muestra (Figura 2).
- Si es necesario, ajuste el enfoque moviendo ligeramente la perilla de enfoque fino del microscopio.
- Elija el campo de visión para la obtención de imágenes moviendo finamente la platina desde la interfaz de la computadora. Esto se puede hacer en la configuración moviendo la cruz sobre la imagen en el software de control del microscopio (Figura 2) que definirá el nuevo centro de la imagen y presionando "Mover etapa". Un buen campo de visión para la adquisición corresponde a una imagen con 10-30 bacterias inmóviles, todas correctamente enfocadas (todas las bacterias están en el mismo plano). Si está interesado en extraer datos de FLIM-FRET de células individuales, asegúrese de que las bacterias estén bien individualizadas (la segmentación de la imagen será mucho más fácil).
