Ensayo de agregación celular para detectar interacciones trans entre moléculas de adhesión celular

Resumen

Fuente: Restrepo, S., et al., Medición de las interacciones transcelulares a través de la agregación de proteínas en un sistema celular heterólogo. J. Vis. Exp. (2020)

En este video, demostramos la técnica para medir las interacciones transcelulares entre las moléculas de adhesión de células sinápticas a través del ensayo de agregación celular HEK. En este ensayo, un número igual de células HEK que expresan una molécula de adhesión celular presináptica deseada y una proteína fluorescente se mezclan con células HEK que expresan una molécula de adhesión celular postsináptica y otra proteína fluorescente. La interacción entre las moléculas de adhesión celular obliga a las células a agregarse, lo que se puede medir mediante microscopía de fluorescencia.

Protocolo

1. Cultivo celular y transfección

1. Elabore medios celulares HEK con DMEM, 1x (Modificación de Dulbecco del medio de Eagle) suplementado con 4,5 g/L de glucosa, L-glutamina y piruvato de sodio, y 10% de FBS. Filtro estéril.
2. Predeterminar los ligandos y receptores adecuados para el ensayo de agregación.
   nota: En este estudio se utilizaron Neurexin3α SS4+/- y uno de sus ligandos conocidos, LRRTM2. Los ligandos y receptores de interés se expresaron a partir de ADNc en pcDNA3.1. Se utilizó un ensamblaje de Gibson para insertar Neurexin3α en pcDNA3.1. Neurexina3α F/R:
   TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGAGCTTTACCCTCCACTC/
   GAGCGGCCGCCACTGTGCTGGATATCTGCAGAATTCTTACACATAATACTCCTTGTCCTT.
3. Prepara HEK293T células.
   1. Cultive células HEK293T hasta la confluencia en un matraz T-75.
   2. Una vez confluente, use 2 mL de tripsina y colóquelo en una incubadora a 37 °C durante 2 min. Agregue 6 mL de medio HEK al matraz para resuspender las células y transfiera los 8 mL a un tubo cónico de 15 mL.
   3. Pellet a 500 x g durante 5 min y resuspender en medios celulares HEK durante un total de 8 mL.
   4. Cuente las células y agregue 735,000 células en cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Ajuste el volumen final a 2 mL para cada pocillo utilizando medios de celda HEK.
   5. Colocar en una incubadora a 37 °C y dejar que las células crezcan durante la noche o hasta que alcancen el 50-60% de confluencia.
4. Transfectar células HEK293T utilizando el método del fosfato de calcio.
   1. Transfectar pocillo-1 con 3 μg de la proteína de interés y co-transfectar con 1 μg de proteína fluorescente (3 μg de pcDNA3.1-Neurexin3α^WT SS4- y 1 μg de mCherry).
   2. Transfecte el pozo-2 como en el paso 1.4.1. pero con la proteína mutada de interés (pcDNA3.1-Neurexin3α^A687T SS4-).
   3. Transfectar el pocillo-3 con 3 μg del ligando de interés y cotransfectar con 1 μg de otra proteína fluorescente (3 μg de pcDNA3.1 LRRTM2 y 1 μg de GFP).
   4. Transfecte el pocillo-4 y el pocillo-5 para que sirvan como controles negativos: pocillo-4 con 1 μg de GFP y pocillo-5 con 1 μg de mCherry.
   5. Prepare otra placa (como en los pasos 1.4.1-1.4.4) si requiere condiciones o controles adicionales (Neurexin3α^WT/A687T SS4+).
      nota: La eficiencia de la transfección se analiza 24 h después de la transfección bajo un microscopio de epifluorescencia y se cuantifica como el número de células que expresan la proteína fluorescente con la que fueron transfectadas. Un enfoque más simplificado incluiría la transfección de células HEK con un vector bicistrónico que codifica una proteína fluorescente y el ligando de interés, y se recomienda encarecidamente por encima de la co-transfección. En el caso de este estudio, las neuronerinas alfa son de ~4.3 kb y se observó una baja intensidad de fluorescencia utilizando un sistema bicistrónico que requiere co-transfección.
5. 48 horas después de la transfección, recoja las células para su agregación.
   1. Lave cada pocillo dos veces con PBS.
   2. Agregue 1 mL de EDTA 10 mM en PBS en cada pocillo para disociar suavemente las interacciones de célula a célula e incubar la placa a 37 °C durante 5 min.
      nota: La tripsina no se recomienda para el paso 1.5.b debido a la posible escisión proteolítica de las moléculas de adhesión en el estudio. Además, después de la adición de EDTA, es posible que el protocolo no se detenga hasta que se complete, ya que las células ahora estarán expuestas a las condiciones ambientales.
   3. Golpee suavemente la placa para separar las células y coseche cada pocillo en tubos cónicos separados de 15 ml.
   4. Centrifugar los tubos cónicos a 500 x g y temperatura ambiente durante 5 min.
6. Mientras se granulan las células, prepare 6 tubos de incubación etiquetando la parte superior de cada tubo de microcentrífuga con cada condición.
   nota: Cada permutación de las condiciones de GFP y mCherry debe utilizarse para abarcar todas las condiciones experimentales y los controles adecuados. Por ejemplo: 1. GFP/mCherry, 2. mCherry/LRRTM2-GFP 3. GFP/Neurexina3α^WT SS4-—mCereza, 4. GFP/Neurexina3α^A687T SS4- –mCereza, 5. Neurexina3α^WT SS4-—mCherry/LRRTM2—GFP, 6. Neurexina3α^A687T SS4- –mCherry/LRRTM2—GFP. Construya tubos adicionales para adaptarse a más condiciones y controles.
7. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 500 μL de medio HEK con 10 mM de CaCl₂ y 10 mM de MgCl₂ calentados a 37 °C.
   nota: La adición de CaCl₂ y MgCl₂ permite que las moléculas de adhesión restablezcan la unión y solo es necesaria si los socios de interacción transcelular en cuestión requieren cationes divalentes para la adhesión.
8. Cuente las células de cada tubo cónico de 15 mL utilizando un hemocitómetro y alícuota 200.000 células de cada condición en un tubo apropiado del paso 1.6 para una mezcla 1:1 en un volumen total de 500 μL.
   nota: Solo debería tomar 5 minutos por condición para contar y las cantidades alícuotas.
9. Incubar los tubos a temperatura ambiente en un rotador lento de tubos.

2. Adquisición de imágenes

1. Optimice los parámetros de adquisición del microscopio para muestras específicas. En este ejemplo, las imágenes se tomaron con un microscopio de campo amplio. Usa un objetivo aéreo 5x (NA: 0.15; WD: 20000 μm) para obtener un campo lo suficientemente grande para el análisis.
2. Evalúe la agregación basal inmediatamente después de mezclar las dos condiciones de las células HEK en el paso 1.8. Estas son ahora las imágenes de 'tiempo cero'.
   1. Pipetear 40 μL de cada mezcla de muestra en un portaobjetos de microscopio cargado e imagen bajo fluorescencia en los canales 488 y 561.
   2. Adquiera tres campos de visión diferentes en un plano de enfoque por gota de muestra.
3. Adquiera las imágenes finales a los 60 minutos como la imagen de 'tiempo 60'.
   1. Para obtener la imagen de "tiempo 60" de la mezcla después de una incubación de 60 minutos, tome otra muestra de 40 μL de cada condición de tubos giratorios y pipetee cada muestra en un portaobjetos cargado. Imagen como en el paso 2.2.
      nota: La agregación celular debe comprobarse cada 15 minutos hasta que se produzca la saturación. El momento de la agregación dependerá de las proteínas que se estén analizando.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Microtubos desechables de 5 mL con tapones a presión	VWR	89000-028	Incubación de una población mixta de células HEK
Unidad de filtro de flujo rápido de 1000 mL, membrana aPES de 0,2 mmm	Termo Fisher	567-0020	Esterilización de medios HEK
Tubos de centrífuga SpectraTube de 15 mL	Ciencia de Ward	470224-998	Recolección de células HEK
Placas de cultivo de tejidos estériles de 6 pocillos	VWR	Teléfono: 100062-892	Cultivo de células HEK
Cloruro de calcio	sigma	223506-500G	Transfección de fosfato de calcio, resuspensión celular HEK
Centrífuga - Sorvall Legend RT	Productos de laboratorio Kendro	75004377	Recolección de células HEK
Incubadora de células de CO2	Termo Científico	HERACELL 150i	Incubación de células HEK durante el crecimiento
DMEM, 1x (Modificación de Dulbecco del medio de Eagle) con 4,5 g/L de glucosa, L-glutamina y piruvato de sodio	Corning	10-013-CV	Mantenimiento de celdas HEK
Solución salina PBS tamponada con fosfato de Dulbecco (1X)	Gibco	14190-144	Célula HEK de paso/recolección
Ácido etilendiaminotetraacético	sigma	ED-500G	Recolección de células HEK
Matraces de cultivo con ventilación Falcon, área de crecimiento de 75 cm2	Corning	9381M26	Cultivo de células HEK
Suero Fetal Bovino	sigma	17L184	Mantenimiento de celdas HEK
HEK293T células	ATCC		Sistema de modelos
ImagenJ	Nih	V: 2.0.0-rc-69/1.52p	análisis de imágenes
Cloruro de magnesio hexahidratado	sigma	M9272-500G	Resuspensión de células HEK
Fosfato de sodio dibásico anhidro	Biorreactivos de Fisher	BP332-500	Transfección de fosfato cálcico
Solución de tripsina al 0,25% (1X)	GE Healthcare Ciencias de la Vida	SH30042.01	Células HEK de paso
Rotador de tubos			Incubación de una población mixta de células HEK
Portaobjetos de microscopio UltraClear. Blanco esmerilado, cargado positivamente	Denville Científico Inc.	M1021	Adquisición de imágenes
Microscopio de campo amplio	Zeiss	Axio Vert 200M	Adquisición de imágenes