NOTA: Este protocolo utiliza cepas de C. elegans en las que ambos están marcados como posibles socios que interactúan. Se recomienda encarecidamente que se utilice una cepa de control negativo, en la que no se espera que una proteína marcada interactúe con otra compañera de interacción candidata marcada. En este caso, se utilizó GFP solo como control negativo para evaluar el fondo, ya que no se espera que DLC-1 interactúe con GFP en el gusano. Se utilizó OMA-1 marcada con GFP como cepa experimental, ya que los datos preliminares sugieren una interacción con DLC-1. Las cepas de nematodos que coexpresan proteínas de control y de prueba con DLC-1 marcado con 3xFLAG se denominan en este texto 3xFLAG::D LC-1; GFP y 3xFLAG::D LC-1; OMA-1::GFP (cepas disponibles bajo pedido; más información en la Tabla de Materiales), respectivamente. Aquí, se utilizan las etiquetas 3xFLAG y GFP; sin embargo, se pueden sustituir otros marcadores siempre que sus anticuerpos sean compatibles con los reactivos del kit de PLA.
1. Cuidado de los animales
- Mantenga los gusanos en placas de medio de crecimiento de nematodos (NGM) sembrados con la cepa OP50 de E. coli y manténgalos a 24 °C para una expresión óptima de GFP.
- Pase los gusanos adultos cada 2-3 días para propagarlos y mantenerlos bien alimentados.
2. Preparación de la cultura sincrónica
- Sincronice los gusanos blanqueando un plato de hermafroditas grávidos bien alimentados. Un protocolo de blanqueo se describe en Porta-de-la-Riva et al. Deje que los embriones eclosionen durante la noche en un tubo de centrífuga a 24 °C mientras rotan de extremo a extremo en 10 mL de tampón de medios mínimos M9 (M9). Esto producirá un cultivo de larvas L1 detenidas.
- Incube el tubo de larvas de la etapa L1 detenidas en hielo durante 10 minutos, luego complete el tubo con hielo 1x M9.
- Utilice una centrífuga para pellet las larvas a 600 x g durante 5 min a 4 °C. Aspire cuidadosamente el sobrenadante para que solo quede 1-2 mL de sobrenadante.
- Vuelva a suspender el pellet de larvas y utilice una micropipeta para transferir 2 μL de cultivo de larvas en suspensión a un portaobjetos de vidrio. Cuente cuántas larvas están presentes para determinar la densidad del cultivo de larvas, lo que ayudará a guiar la siembra de los gusanos en el paso 2.5.
nota: Una densidad de 10-15 L1 larvas/1 μL funciona bien para la siembra.
- Utilice una micropipeta para transferir el volumen de cultivo de larvas necesario para sembrar aproximadamente 100-120 larvas en estadio L1 en una placa OP50 de 60 mm. Por ejemplo, siembre 10 μL de un cultivo de larvas que tenga una densidad de 10 L1 larvas/1 μL de cultivo.
nota: No exceda un volumen de 40 μL para sembrar las larvas, o el exceso de líquido alterará el césped OP50. Si el volumen de cultivo supera los 40 μL, repita los pasos 2.3-2.4 para reducir aún más el volumen y aumentar la densidad del cultivo de larvas.
- Cultive lombrices a 24 °C. Registre el momento en que las L1 se siembran en placa y verifique periódicamente la etapa de desarrollo para identificar el momento ideal para la disección><.
nota: A las 52 h después de la siembra de L1s, los gusanos cultivados a 24 °C se encuentran típicamente en la etapa de adulto joven, que es la etapa ideal para la disección del PLA dirigido a las gónadas. Sin embargo, el momento real en el que los gusanos sincronizados alcanzan la etapa de adulto joven puede variar según las cepas y la temperatura de incubación.
3. Disección/extrusión de gónadas
NOTA: La disección para extruir la gónada es necesaria para que el PLA dirigido a la gónada funcione con éxito. Este enfoque también puede liberar embriones, que también funcionan utilizando este protocolo para el PLA (consulte la Discusión para obtener más información). Después de la disección, tanto las muestras de control negativo como las experimentales se fijan y se tratan juntas para detectar PLA en paralelo. También se sugiere que se prepare un conjunto adicional de muestras con el propósito de coinmunotinción fluorescente para demostrar los patrones de expresión de las proteínas asociadas de interés.
- Recoge de 30 a 40 gusanos adultos jóvenes en un plato de vidrio de reloj que contenga 500 μL de 1x M9 + levamisol (concentración final de 2,5 mM). Después de recolectar los gusanos, retire y deseche con cuidado la mayoría de los medios para eliminar las bacterias que se transfieren junto con los gusanos.
- Agregue 500 μL frescos de 1x M9 + levamisol y use la pipeta para extraer y dispensar suavemente el medio para enjuagar los gusanos. Retire y deseche con cuidado la mayor parte de los medios para eliminar las bacterias que se transfieren junto con los gusanos.
- Repita este paso 2 o 3 veces hasta que se eliminen todas las bacterias. Una vez completados los lavados, deje las lombrices en unos 100 μL de medio para mantenerse hidratadas.
nota: No permita que los gusanos permanezcan en el medio durante más de 7 minutos, ya que esto perjudicará la extrusión de las gónadas durante la disección. Realice lavados con la ayuda de un microscopio de disección para controlar la eliminación de los medios y evitar que los gusanos se pierdan.
- Utilizando una pipeta de vidrio o polietileno, transfiera los gusanos a un portaobjetos de microscopio de 25 mm x 75 mm recubierto con 0,001% de poli-L-lisina (los portaobjetos utilizados en este procedimiento tienen un perímetro recubierto de epoxi, dejando tres espacios de trabajo, de 14 mm x 14 mm cada uno). Retire el exceso de medio para que queden aproximadamente 10-15 μL de medio.
- Bajo la ayuda de un microscopio de disección y usando dos agujas de calibre 261/2, coloque una aguja sobre la otra de modo que los extremos formen un par de tijeras. Usando agujas orientadas de esta manera, corte los gusanos detrás de la faringe para liberar las líneas germinales. Diseccione todos los gusanos en 5 minutos.
nota: Se pueden encontrar más detalles sobre cómo realizar disecciones en una publicación anterior de Gervaise y Arur.
- Después de diseccionar todos los gusanos, coloque suavemente un cubreobjetos de 22 mm x 40 mm sobre el portaobjetos para que quede perpendicular al portaobjetos. Los extremos del cubreobjetos deben colgar de la corredera.
- Congele los portaobjetos en un bloque de aluminio preenfriado que se mantenga sobre hielo seco durante al menos 20 minutos. Coloque suavemente un lápiz frío encima del cubreobjetos para evitar que el cubreobjetos se afloje debido a la expansión del hielo.
4. Fijación/bloqueo
- Cuando esté listo para la fijación, retire las cubreobjetos con un lápiz u otra herramienta de filo romo e inmediatamente sumerja el portaobjetos en un frasco que contenga metanol fresco y helado (enfriado a -20 ° C) durante 1 min.
- Limpie suavemente los bordes del portaobjetos que rodean la muestra para que el siguiente reactivo quede sujeto a la tensión superficial alrededor de la muestra. Aplicar 150 μL de fijador (2% de formaldehído en 100 mM KH2PO4, pH = 7,2) durante 5 min a RT.
nota: También hemos probado un procedimiento de fijación de metanol/acetona y hemos comprobado que es compatible con la reacción del PLA.
- Toque el portaobjetos con una toalla de papel en un ángulo perpendicular de 90° para que el fijador se escurra y se absorba en la toalla de papel. Bloquee los portaobjetos 2 veces durante 15 minutos en RT en un frasco Coplin con 50 mL de 1x PBS/1% Triton X-100/1% albúmina sérica bovina (PBT/BSA).
nota: Se recomiendan frascos de coplin u otros tipos de frascos para manchar para este paso de bloqueo y los pasos de lavado que se indican a continuación en las secciones 6-9. Estos proporcionan volúmenes suficientes para un intercambio eficiente de tampón de bloqueo o lavado con la muestra.
- Bloquee los portaobjetos con una solución de PBT/BSA que contenga un 10% de suero de cabra normal. Limpie suavemente los bordes que rodean el portaobjetos y aplique 100 μL de la solución al portaobjetos. Incubar durante 1 h a RT en una cámara húmeda.
nota: Este paso es muy recomendable para la tinción con el anticuerpo primario αFLAG. La cámara húmeda se construye asegurando pipetas de vidrio con cinta adhesiva en la bandeja para que los portaobjetos se coloquen mientras se incuban. Se colocan toallitas húmedas (Tabla de materiales) en la bandeja para aumentar la humedad interna de la bandeja y evitar la evaporación. La tapa y la bandeja están cubiertas con papel de aluminio para proteger las muestras de la luz durante los pasos sensibles a la luz.
- Coloque el portaobjetos sobre una toalla de papel para dejar que la solución de PBT/BSA/10%NGS se escurra por el portaobjetos y limpie suavemente los bordes del portaobjetos. Utilice el reactivo de bloqueo (Tabla de materiales) para bloquear portaobjetos. Aplique una gota en el espacio de 14 mm x 14 mm. Incubar los portaobjetos durante 1 h a 37 °C en una cámara húmeda.
5. Incubación primaria de anticuerpos
>NOTA: Para obtener los mejores resultados de PLA y un fondo mínimo, el factor de dilución de los anticuerpos primarios puede requerir optimización (consulte la Discusión para obtener más detalles). Además, los anticuerpos primarios deben elevarse en diferentes huéspedes que coincidan con la especificidad de los anticuerpos secundarios utilizados para el PLA.
- Coloque el portaobjetos sobre una toalla de papel para dejar que el reactivo de bloqueo se escurra por el portaobjetos y limpie suavemente los bordes. Utilice el diluyente de anticuerpos (Tabla de materiales) para diluir los anticuerpos primarios. Aplique 40 μL de solución de anticuerpos primarios por espacio de 14 mm x 14 mm.
- Incubar los portaobjetos en una cámara húmeda durante la noche a 4 °C.
6. Incubación de sonda PLA (anticuerpo secundario)
NOTA: Para los pasos 6-9, utilice los tampones de lavado A y B en RT. Si los tampones se almacenan a 4 °C, deje que se calienten a RT antes de usarlos.
- Lave los portaobjetos 2 veces durante 5 minutos con 50 mL de 1 tampón de lavado A (Tabla de Materiales) a RT en un frasco Coplin. Coloque el frasco Coplin en un agitador orbital a 60 rpm.
- Coloque el portaobjetos sobre una toalla de papel para dejar que el tampón de lavado se escurra por el portaobjetos y limpie suavemente los bordes. Prepare una solución de 40 μL que contenga sondas PLUS y MINUS (diluida 1:5 con diluyente de anticuerpos). Aplique la solución a cada espacio de 14 mm x 14 mm.
- Incubar los portaobjetos en una cámara húmeda durante 1 h a 37 °C.
7. Ligadura
- Portaobjetos de lavado 2 veces durante 5 minutos con 50 mL de 1x tampón de lavado A en RT en un frasco Coplin. Coloque el frasco Coplin en un agitador orbital a 60 rpm.
- Diluir el tampón de ligadura (Tabla de Materiales) 1:5 con agua ultrapura. Utilice este tampón para diluir la ligasa (Tabla de materiales) 1:40 para preparar un stock de trabajo de solución de ligadura.
- Coloque el portaobjetos sobre una toalla de papel para dejar que el tampón de lavado se escurra por el portaobjetos y limpie suavemente los bordes. Aplique 40 μL de la solución de ligadura a cada espacio de 14 mm x 14 mm.
- Incubar los portaobjetos en una cámara húmeda durante 30 min a 37 °C.
8. Amplificación
NOTA: El uso de reactivos de detección con fluoróforos rojos (Tabla de Materiales) da como resultado la menor cantidad de fondo en el tejido de C. elegans.
- Portaobjetos de lavado 2 veces durante 5 minutos con 50 mL de 1x tampón de lavado A en RT en un frasco Coplin. Coloque el frasco Coplin en un agitador orbital a 60 rpm.
- Diluir el tampón rojo de amplificación (Tabla de Materiales) 1:5 con agua ultrapura. Utilice este tampón para diluir la polimerasa (Tabla de materiales) 1:80 para preparar un material de trabajo de solución de amplificación y protegerlo de la luz.
- Coloque el portaobjetos sobre una toalla de papel para dejar que el tampón de lavado se escurra por el portaobjetos y limpie suavemente los bordes. Aplique 40 μL de la solución de amplificación a cada espacio de 14 mm x 14 mm.
- Incubar los portaobjetos en una cámara húmeda durante 1 h y 40 min a 37 °C. Asegúrese de que la cámara húmeda esté cubierta con papel de aluminio para proteger las muestras de la luz.
9. Lavados finales
- Lave los portaobjetos 2 veces durante 10 minutos con 50 mL de 1x tampón de lavado B (Tabla de Materiales) en RT en un frasco Coplin. Coloque el frasco Coplin en un agitador orbital a 60 rpm.
- Lava los portaobjetos 1x durante 1 minuto con 50 mL de tampón de lavado 0,01x B en RT en un frasco Coplin. Coloque el frasco Coplin en un agitador orbital a 60 rpm. Este tampón se prepara diluyendo el tampón de lavado B con agua ultrapura.
10. Montaje de cubreobjetos
- Deje que el exceso de tampón de lavado se escurra por el portaobjetos y pase a una toalla de papel y limpie cualquier resto de tampón que quede en el perímetro recubierto de epoxi del portaobjetos.
- Agregue 10 μL de medio de montaje (Tabla de materiales) a la muestra y coloque suavemente un cubreobjetos en la parte superior, permitiendo que el medio de montaje se extienda.
- Pinta alrededor del borde del cubreobjetos con esmalte de uñas para sellar el cubreobjetos y el portaobjetos. Sea cuidadoso con la aplicación de esmalte de uñas para evitar mover el cubreobjetos, lo que dañará las líneas germinales. Deje que el esmalte de uñas se endurezca durante al menos 20 minutos en RT, mientras los portaobjetos se protegen de la luz, antes de verlo bajo un microscopio.
