1. Inmunoprecipitación
NOTA: Utilizamos tampón de lisis de dodecil sulfato de sodio (SDS) y elución de citrato, como se describe en las siguientes secciones. Sin embargo, el uso de una técnica alternativa de inmunoprecipitación interna también puede ser aplicable para la preparación de muestras de LC-MS/MS.
- Transfecte células cultivadas con vectores que codifican una etiqueta de epítopo sola o una proteína de fusión. Para adquirir datos representativos, transfiera células J774 (1 x 106) con vectores que codifican una proteína verde fluorescente (GFP) sola o Capn6 fusionada con GFP (gen de la calpaína-6) utilizando liposomas catiónicos.
- Anticuerpo conjugado a perlas magnéticas.
- Para ello, mezcle el anticuerpo anti-GFP (2 μL/reacción) con perlas magnéticas (25 μL/reacción) en 500 μL de tampón de fosfato de citrato (24,5 mM de ácido cítrico, 51,7 mM de fosfato sódico dibásico; pH 5,0) en un tubo de ensayo de 1,5 mL.
- Gire la mezcla a 50 rpm durante 1 h a temperatura ambiente. A continuación, lavar las perlas conjugadas con IgG tres veces con tampón de fosfato de citrato que contiene un 0,1% de monolaurato de sorbitán de polioxietileno (20).
- Lisar las células transfectadas utilizando un tampón de lisis adecuado. Para obtener datos representativos, lisar las células transfectadas durante 30 min en hielo en 400 μL de tampón de lisis (50 mM de Tris-HCl; pH 7,5, 120 mM de NaCl, 0,5% de éter de poli(oxietileno) octilfenilo) que contenga 40 μmol/L de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 50 μg/mL de leupeptina, 50 μg/mL de aprotinina, 200 μmol/L de ortovanadato de sodio, y 1 mM de ácido etilenglicol tetraacético (EGTA) en tubos de ensayo de 1,5 mL 24 h después de la transfección.
- Limpiar el lisado centrifugando a 15.000 x g durante 5 min y recoger el sobrenadante.
- Preclear el lisado. Agregue perlas magnéticas sin etiquetar (25 μL/reacción) en un tubo de ensayo de 1,5 mL. Lave las perlas tres veces con 500 μL de tampón de fosfato de citrato. Después de la eliminación del tampón de fosfato de citrato en el lavado final, agregue el lisado celular sobre las perlas magnéticas. Gire la mezcla usando un rotador a 50 rpm durante 30 min a temperatura ambiente.
- Coloque el tubo de ensayo en un soporte magnético durante 5 minutos para la separación magnética y recoja el lisado celular. Se recomienda el uso del soporte magnético designado por el fabricante.
- Une las proteínas objetivo a las perlas conjugadas. Coloque las perlas conjugadas con inmunoglobulina (Ig)G en un soporte magnético durante 5 minutos para la separación magnética, deseche el tampón de citrato y, a continuación, añada el lisado celular a las perlas separadas.
- Gire la mezcla a 50 rpm durante 1 h a temperatura ambiente.
- Separe las proteínas diana de las proteínas no diana libres. Lave las perlas tres veces con 500 μL de tampón de fosfato de citrato que contiene un 0,1% de monolaurato de sorbitán de polioxietileno (20). Después del lavado final, añadir 30 μL de tampón de citrato (pH 2-3) e incubar durante 5 min a temperatura ambiente para eluir las proteínas objetivo.
nota: Si la recuperación de la inmunoprecipitación es insuficiente, el uso de marcadores de epítopos alternativos, como FLAG o HIS, puede mejorar la eficiencia. Si la eficiencia de la elución es insuficiente, el uso de otros eluyentes, como una solución basada en SDS, puede mejorar la eficiencia.
2. Digestión de proteínas en la membrana
NOTA: El uso de materiales y equipos libres de proteínas es necesario para evitar la contaminación con proteínas exógenas. Además, se recomienda que el operador use una mascarilla quirúrgica y guantes para evitar la contaminación por proteínas humanas.
- Corte las membranas de PVDF en trozos de 3 mm x 3 mm con unas tijeras quirúrgicas que se hayan limpiado con metanol y se hayan secado inmediatamente antes de su uso.
- Agregue de 2 a 5 μl de etanol a las piezas de membrana de PVDF sobre papel de aluminio limpio.
- Antes de que se sequen por completo, agregue el eluyente (2-5 μL cada uno, 4-6 piezas por muestra) sobre las membranas de PVDF hidrófilo y luego seque las membranas al aire hasta que la superficie de la membrana se vuelva mate. Las membranas secas se pueden almacenar a 4 °C.
- Transfiera todas las membranas a tubos de plástico de 1,5 mL, agregue 20-30 μL de etanol para hacer que las membranas sean hidrófilas y luego retire el etanol con una pipeta.
- Antes de que la membrana se seque por completo, añadir 200 μL de solución de reacción a base de ditiotreitol (DTT) (80 mM de NH4HCO3, 10 mM de DTT y 20% de acetonitrilo) e incubar a 56 °C durante 1 h.
- Sustituya la solución de reacción por 300 μL de solución de yodoacetamida (80 mM de NH4HCO3, 55 mM de yodoacetamida y 20% de acetonitrilo) e incube durante 45 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Lave las membranas dos veces con 1 mL de agua destilada y una vez con 1 mL de acetonitrilo al 2% mezclando en vórtice durante >10 s.
- Disuelva la tripsina liofilizada de grado MS (Tabla de materiales) directamente en la solución de reacción (30 mM de NH4HCO3 que contiene 70% de acetonitrilo). Añadir 100 μL de la solución de reacción que contenga 1 μg de tripsina (Tabla de Materiales) (30 mM de NH4HCO3 que contenga un 70% de acetonitrilo) e incubar a 37 °C durante la noche.
- Transfiera la solución de reacción que contiene los digestores trípticos a un tubo de ensayo limpio de 1,5 ml con una pipeta.
- Añadir 100 μL de solución de lavado (70% acetonitrilo/1% ácido trifluoroacético) a la membrana e incubar a 60 °C durante 2 h. Recoger la solución de lavado y mezclarla con la solución de reacción. Añadir otros 100 μL de solución de lavado a la membrana y sonicarla durante 10 min. A continuación, recoge la solución de lavado y mézclala con la solución de reacción.
- Cubre el tubo de ensayo con un trozo de película de laboratorio y haz un par de agujeros pequeños con una aguja. Seque la solución con un concentrador de vacío.
- Disolver el residuo en 10 μL de ácido fórmico al 0,2%. Después de la centrifugación (12.000 × g, 3 min a temperatura ambiente), transfiera el sobrenadante a un tubo de muestra.
nota: Los lavados son los pasos críticos de esta sección. Durante la digestión de proteínas en la membrana, el lavado de las membranas que contienen las proteínas inmovilizadas después de la reducción y la alquilación con agua destilada, seguido de acetonitrilo al 2%, durante más de 10 segundos cada uno, es fundamental para la eliminación de los reactivos.
