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1. Hidratación con biosensores y configuración de ensayos
- Encienda la máquina BLItz.
- Asegúrese de que la máquina esté conectada a la computadora a través de un puerto de salida de datos USB en la parte posterior de la máquina.
- En la computadora, abra el software asociado (por ejemplo, BLItz Pro) y haga clic en Advanced Kinetics en el lado izquierdo de la pantalla.
- En el software, escriba toda la información apropiada sobre el experimento (incluido el nombre del experimento, la descripción, la identificación de la muestra y la concentración de proteínas) debajo de cada encabezado respectivo.
- Haga clic en Tipo de biosensor y elija Ni-NTA en el menú desplegable.
- En el encabezado Configuración de ejecución, compruebe que el agitador esté establecido en Habilitar.
- En el encabezado Lista de tipos de pasos, compruebe que hay 5 elementos enumerados: Línea base inicial, Carga, Línea base, Asociación y Disociación.
nota: La duración de cada paso se puede cambiar de forma predeterminada según sea necesario. Para obtener resultados óptimos, utilice un mínimo de 30 s para la línea de base inicial y la línea de base; y 120 s para Asociación y Disociación. La duración de la etapa de carga (que oscila entre 120 y 240 s) dependerá de la concentración del ligando y de la afinidad de la etiqueta del epítopo His en el ligando con el biosensor de Ni-NTA.
- Retire el biosensor de Ni-NTA hidratado del tubo de PCR y fíjelo al soporte del biosensor en la máquina deslizando la parte ancha del biosensor en el soporte.
nota: No deje que el biosensor se seque durante el experimento.
- Coloque un tubo de microcentrífuga negra de 0,5 mL en el soporte del tubo de la máquina y pipetee 400 μL del tampón BLI en él.
- Verifique que el control deslizante de la máquina esté colocado de manera que el soporte del tubo esté situado frente a la flecha negra de la máquina.
- Cierre la tapa de la máquina de modo que la punta del biosensor se sumerja en el tampón del tubo de microcentrífuga.
- Haga clic en Siguiente en el software para comenzar a registrar la línea de base inicial.
2. Carga de ligando en el biosensor
- Una vez que el paso de línea base inicial haya terminado de grabarse, abra la cubierta de la máquina.
- Mueva el control deslizante hacia la derecha de modo que el soporte de caída (en lugar del soporte del tubo) esté situado frente a la flecha negra.
- Pipetear 4 μL de un ligando marcado con His dializado en el soporte de gotas y cerrar la tapa de la máquina.
NOTA: La concentración óptima del ligando a utilizar puede variar para cada proteína. Una concentración entre 1,0 y 2,0 mg/mL suele ser adecuada para saturar el NTA en la punta del biosensor en 240 s.
- En el software, haga clic en Siguiente para comenzar a cargar.
3. Lavar el ligando adicional
- Una vez que el paso de carga haya terminado de grabar, abra la tapa de la máquina.
- Mueva el control deslizante hacia la izquierda de modo que el soporte del tubo vuelva a estar situado frente a la flecha negra.
- Cierre la tapa de la máquina y asegúrese de que la punta del biosensor esté sumergida en el tampón BLI del tubo en el soporte del tubo.
- Haga clic en Siguiente una vez más en el software para comenzar a registrar la línea base.
4. Asociación del analito al ligando
- Una vez que el paso de línea base haya terminado de grabar, abra la tapa de la máquina.
- Retire el portagotas y límpielo pipeteando cualquier proteína y enjuagándolo con agua doblemente desionizada (ddH2O) un total de 5 veces.
- Use una toallita de papel para limpiar la superficie del soporte de gotas después del lavado.
- Vuelva a colocar el soporte de caída en la máquina.
- Mueva el control deslizante de la máquina hacia la derecha de modo que el soporte de caída vuelva a estar situado frente a la flecha negra.
- Pipetear 4 μL de un analito dializado en el soporte de caída y cerrar la tapa de la máquina.
- En el software, haga clic en Siguiente para iniciar la asociación.
5. Disociación del analito del ligando
- Una vez que el paso de asociación haya terminado de grabar, abra la tapa de la máquina.
- Mueva el control deslizante de la máquina hacia la derecha de modo que el soporte del tubo vuelva a estar situado delante de la flecha negra.
- En el software, haga clic en Siguiente para comenzar la disociación.
- Una vez que el paso de disociación haya terminado de grabar, abra la tapa de la máquina.
- Retire el soporte de caída y el soporte del tubo.
- Enjuague ambos con ddH2O a fondo para eliminar cualquier proteína.
- Retire el biosensor y deséchelo de forma segura.