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1. Preparación de la muestra: Ensayo de mezcla célula-célula
NOTA: El siguiente protocolo describe el procedimiento de mezcla para las células adherentes. Puede modificarse para células cultivadas en suspensión.
- Siembre un número apropiado de células en una placa de 6 pocillos, por ejemplo, 800.000 células HEK 293T (contadas con una cámara de recuento de Neubauer), un día antes de la transfección. El número puede modificarse en función del tiempo transcurrido entre la siembra y la transfección y ajustarse para otros tipos de células. Para realizar un experimento básico (es decir, proteínas de interés y control negativo), prepare al menos 4 pocillos. Cultivo de células a 37 °C, 5% de CO2 en el medio Eagle Medium Modificado (DMEM) de Dulbecco, suplementado con suero fetal bovino (10%) y L-glutamina (1%).
- Transfecte las celdas de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
- Para realizar un experimento básico, transfecte, en pocillos separados, plásmidos para la proteína de interés fusionada con una proteína fluorescente 'verde' (por ejemplo, proteína fluorescente verde mejorada monomérica (mEGFP) o proteína fluorescente amarilla (mEYFP)) o 'roja' (por ejemplo, mCherry o mCardinal).
nota: En este protocolo, nos centramos en APLP1-mEYFP y APLP1-mCardinal, y el correspondiente control negativo, por ejemplo, miristoilado-palmitoilado-mEYFP (myr-palm-mEYFP) y -mCardinal (myr-palm-mCardinal). Generalmente, 200 ng - 1 μg de ADN plasmídico es suficiente. La alta eficiencia de transfección aumenta la posibilidad de encontrar células "rojas" y "verdes" en contacto. Modifique la cantidad de plásmido y reactivo de transfección para optimizar la eficiencia de la transfección. crítico: La confluencia celular debe ser de alrededor del 70% al transfectar las células. Si las células son demasiado confluentes, la eficiencia de la transfección disminuirá. Si las células no son lo suficientemente confluentes, la transfección y la mezcla pueden inducir estrés e impedir que muchas células se adhieran adecuadamente después de mezclarse.
- Realice la mezcla de células ~ 4 ± 2 h después de la transfección.
- Retire el medio de crecimiento y lave cada pocillo suavemente con 1 mL de PBS suplementado con Mg2+ y Ca2+. A continuación, retire el PBS. (Crítico) Deje caer PBS en el borde del pocillo para evitar el desprendimiento de las células durante el lavado.
- Agregue ~ 50 μL de solución de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) de tripsina gota a gota a cada pocillo para facilitar el desprendimiento de las células. Incubar a 37 °C durante 2 min. Luego, agite lentamente la placa de 6 pocillos lateralmente para separar las células.
nota: Es posible que se requieran tiempos de incubación prolongados para algunos tipos de células.
- Agregue 950 μL de medio de crecimiento a cada pocillo y vuelva a suspender las células pipeteando varias veces hacia arriba y hacia abajo, separando así todas las células del fondo del pocillo. (Crítico) Asegúrese de que las células se resuspendan correctamente y se separen unas de otras comprobando visualmente la ausencia de agregados de células grandes después de la resuspensión. De lo contrario, se obtendrán muchos contactos 'rojos'-'rojos' o 'verdes' después de mezclar.
- Transfiera la solución celular de un pocillo (proteína de interés o control negativo) al pocillo correspondiente, es decir, células 'rojas' (p. ej., transfectadas con APLP1-mCardinal) a células 'verdes' (p. ej., transfectadas con APLP1-mEYFP). Mezcle pipeteando suavemente unas cuantas veces hacia arriba y hacia abajo. A continuación, se siembraron las células mezcladas en placas con fondo de vidrio de 35 mm (1 mL de solución de células mezcladas por placa, más 1 mL de medio de crecimiento) y se cultivaron las células sembradas durante otro día a 37 °C, 5% de CO2.
2. Preparación de la muestra: control positivo para experimentos de correlación cruzada y constructo de homodímero para el análisis de brillo
- Siembre 600.000 células HEK 293T, contadas con una cámara de recuento de células, en platos con fondo de vidrio de 35 mm un día antes de la transfección. Cultive las células a 37 °C, 5% de CO2 en un medio DMEM completo (ver paso 1.1) durante otro día.
- Transfecte las células con ~ 250 ng de ADN plasmídico de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para el control de correlación cruzada positiva, utilice un plásmido que codifique un heterodímero de proteína fluorescente anclado a la membrana, por ejemplo, myr-palm-mCherry-mEGFP o myr-palm-mCardinal-mEYFP correspondiente a las FP de la proteína de interés. Para la calibración del brillo, utilice plásmidos que codifiquen tanto un monómero FP anclado a la membrana como un dímero homo correspondiente a los FP fusionados con la proteína de interés, por ejemplo, myr-palm-mEYFP y myr-palm-mEYFP-mEYFP para calibrar el análisis de brillo de APLP1-mEYFP.
- Cultive las células a 37 °C, 5% de CO2 en medio DMEM completo (ver paso 1.1) durante otro día.
3. Microscopía de barrido láser confocal: configuración y calibración del volumen focal
NOTA: El siguiente protocolo está escrito para experimentos realizados con mEGFP/mEYFP y mCherry/mCardinal en el microscopio confocal de barrido láser utilizado en este estudio. La configuración óptica, la configuración del software (líneas láser, espejos dicroicos, filtros) y la elección de los tintes de calibración pueden modificarse para otras configuraciones de MF y microscopios.
- Encienda el microscopio y los láseres al menos una hora antes del experimento para garantizar la estabilidad del láser y el equilibrio de la temperatura.
- Prepare 100-200 μL de soluciones apropiadas de colorante fluorescente soluble en agua (consulte la Tabla de Materiales para ver ejemplos) en agua o PBS para calibrar el volumen focal, con concentraciones en el rango de 10-50 nM.
- Coloque las soluciones de tinte en un plato limpio de 35 mm con fondo de vidrio # 1.5, es decir, que tenga un grosor de 0.16-0.19 mm.
nota: Lo ideal es utilizar platos con cubreobjetos de alto rendimiento que tengan una tolerancia de espesor baja, por ejemplo, de 0,170 ± 0,005 mm, lo que permite una corrección óptima del anillo del collar (paso 3.6). Es importante utilizar el mismo tipo de plato que se utilizó posteriormente para los siguientes experimentos.
- Coloque el plato que contiene la solución de tinte directamente sobre el objetivo (preferiblemente, inmersión en agua, con NA 1.2) para asegurar el enfoque en la solución. Alternativamente, coloque la placa en el portamuestras y concéntrela en la muestra (por ejemplo, 10-20 μm por encima del fondo de la placa).
NOTA: No recomendamos el uso de objetivos de aceite debido a la mala señal que se obtiene al enfocar profundamente en muestras acuosas.
- Configure la ruta de excitación y emisión, por ejemplo, elija el láser de 488 nm, un espejo dicroico de 488/561 nm, una ventana de detección de 499-552 nm y un tamaño de orificio de 1 unidad Airy (AU). Asegúrese de que el tamaño del agujero sea el mismo que el que se utilizará en las mediciones de correlación cruzada.
- Ajuste la posición del orificio (ajuste del orificio) y el anillo del collar del objetivo para maximizar la tasa de conteo. Para ello, gire el anillo del collar hasta que se detecte la tasa de conteo máxima.
nota: La corrección del anillo del collar tiene en cuenta el grosor específico del vidrio de cobertura utilizado. Maximizar la tasa de recuento, es decir, recolectar tantos fotones por molécula como sea posible, es crucial para maximizar la relación señal-ruido (SNR) de las mediciones.
- Realice una serie de mediciones puntuales de FCS (por ejemplo, 6 mediciones en diferentes ubicaciones, cada una de las cuales consta de 15 repeticiones de 10 s, es decir, 2,5 minutos de tiempo total, muestreadas con un tiempo de permanencia de 1 μs o menos) a la misma potencia láser que se utiliza en las mediciones de correlación cruzada (normalmente ~1%, es decir, ~1-2 μW).
- Ajuste un modelo de difusión tridimensional que incluya una contribución de triplete (Ecuación 1) a los datos.
nota: Por lo general, los tiempos de difusión obtenidos son de alrededor de 30 μs y el factor de estructura es de alrededor de 4-8.
- Calcule la cintura w0 a partir del tiempo de difusión promedio medido y los valores publicados para el coeficiente de difusión del tinte utilizado a temperatura ambiente de acuerdo con la Ecuación 2.
Los valores típicos son de 200 a 250 nm.
- Repita la rutina de calibración (pasos 3.4-3.9) con un colorante fluorescente diferente para un segundo canal de detección si es necesario (por ejemplo, excitación de 561 nm y detección entre 570 nm y 695 nm). Mantenga la posición y el tamaño del orificio tal como se estableció para el primer canal de detección.
- Calcule el brillo molecular (Ecuación 3) a partir de las mediciones de calibración y almacene los valores obtenidos.
nota: Los valores típicos para la configuración utilizada son ~8-10 kHz/molécula (MOL) para una potencia de excitación de 1,8 μW a 488 nm. Los valores más bajos de lo habitual pueden indicar suciedad en el objetivo, desalineación de la configuración o una salida láser reducida. Compruebe y almacene regularmente las potencias de salida del láser en el objetivo utilizando un medidor de potencia. Para la comparación de diferentes configuraciones, el brillo molecular normalizado por la potencia del láser de excitación es el parámetro más significativo para evaluar el rendimiento del microscopio.
4. Espectroscopía de correlación cruzada de fluorescencia de barrido: Adquisición
NOTA: El siguiente protocolo está escrito para experimentos realizados con mEGFP/mEYFP ('verde') y mCherry/mCardinal ('rojo') en el microscopio confocal de barrido láser utilizado en este estudio. La configuración óptica y la configuración del software (líneas láser, espejos dicroicos, filtros) pueden ser diferentes para otros FP o configuraciones de microscopio.
- Configure la ruta óptica, por ejemplo, excitación de 488 nm y 561 nm y un espejo dicroico de 488/561 nm, agujero de alfiler en 1 UA para excitación de 488 nm. Para evitar la diafonía espectral, seleccione dos pistas separadas para excitar y detectar mEGFP/mEYFP (excitación de 488 nm, canal verde) y mCherry/mCardinal (excitación de 561 nm, canal rojo) secuencialmente y seleccione las pistas de cambio de cada línea. Para la detección, utilice filtros apropiados para ambos canales, por ejemplo, 499-552 nm en el canal verde y 570-695 nm en el canal rojo.
- Si no es posible la excitación alterna, utilice la configuración de filtro adecuada para el canal rojo a fin de minimizar la diafonía espectral (es decir, detectar fluorescencia mCherry/mCardinal no inferior a 600 nm). Esto puede reducir la cantidad de fotones detectados en el canal rojo y, por lo tanto, reducir la SNR.
- Coloque el plato que contiene las células mezcladas en el portamuestras. Espere al menos 10 minutos para garantizar el equilibrio de la temperatura y reducir la desviación del enfoque.
- Enfoque en las celdas usando la luz de transmisión en el menú Localizar.
- Busque un par de celdas "rojas" y "verdes" en contacto entre sí. Para la correlación cruzada positiva o el control de brillo de homodímero (ver sección 2), busque una célula aislada que emita fluorescencia en ambos canales o la señal de homodímero respectiva en el PM.
NOTA: (Crítico) Minimice la exposición de la muestra mientras busca células para evitar el preblanqueo, lo que puede reducir la correlación cruzada. Por lo tanto, escanee a la velocidad de escaneo más rápida y con bajas potencias de láser. Para evitar la saturación del detector mientras se obtienen imágenes de células que expresan fuertemente, busque en el modo de integración. Sin embargo, para minimizar la exposición, es posible escanear a potencias láser más bajas en el modo de conteo de fotones.
- Seleccione una ruta de escaneo perpendicular al contacto celda-celda (o a PM de una sola celda para la correlación cruzada positiva o el control de brillo de dímero homo) usando el botón Recortar como se muestra en las Figuras 1B y 2A.
nota: Algunos microscopios antiguos no permiten direcciones de exploración arbitrarias. En este caso, se deben localizar los contactos célula-célula con una orientación perpendicular a la dirección de escaneo.
- Zoom para lograr un tamaño de píxel de 50-200 nm y seleccione Línea en modo de escaneo. Establezca el tamaño de fotograma en 128 × 1 píxeles.
nota: El tamaño de píxel típico es de 160 nm, lo que corresponde a una longitud de escaneo de alrededor de 20 μm.
- Establezca la velocidad de escaneo en el valor máximo permitido, por ejemplo, 472,73 μs por línea.
nota: Para un esquema de excitación alternativo, esto corresponde a un tiempo de escaneo de 954,45 μs, es decir, ~1000 escaneos/s en la configuración utilizada. La velocidad de escaneo se puede ajustar en función del coeficiente de difusión de la proteína de interés. En el caso de las proteínas ancladas a la membrana, los tiempos de difusión típicos son de unos 10-20 ms. El tiempo de escaneo debe ser al menos diez veces menor que los tiempos de difusión. Las velocidades de escaneo más bajas pueden inducir un fotoblanqueo más fuerte y requieren potencias de iluminación más bajas. Alternativamente, se puede imponer una pausa, por ejemplo, 5 ms, entre cada escaneo para complejos de difusión muy lenta usando Intervalo en el submenú Series temporales.
- Elija las potencias láser adecuadas, por ejemplo, ~1-2 μW para 488 nm y ~5-10 μW para excitación de 561 nm.
nota: Las potencias láser más altas mejoran la SNR, pero aumentan el fotoblanqueo. Por lo tanto, las potencias del láser deben elegirse de manera que el fotoblanqueo sea inferior al 50% de la tasa de recuento inicial.
- Establezca los ciclos en 100,000-500,000.
nota: El número de escaneos, es decir, la duración de la medición, puede variar: los tiempos de medición más largos mejorarán la SNR y pueden ser más apropiados para moléculas que se difunden lentamente, sin embargo, el movimiento de las células y el fotoblanqueo limitan el tiempo máximo de medición. Los datos presentados aquí se adquirieron de forma rutinaria durante ~3-6 min, es decir, 200.000-400.000 escaneos de línea.
- Configure los detectores en el modo de conteo de fotones. Presione Iniciar experimento para iniciar la adquisición. Repita los pasos 4.5-4.11 para medir otra celda.
nota: Se recomienda medir de 10 a 15 células por muestra a diferentes niveles de expresión. (Crítico) Evite la saturación del detector a altos niveles de expresión. La velocidad de conteo máxima no debe exceder ~ 1 MHz.
- Si se lleva a cabo un análisis de brillo para determinar los estados oligoméricos, realice mediciones de calibración de brillo de homodímero de acuerdo con los pasos modificados 4.1-4.11: Mida cada dímero homo-dímero de proteína fluorescente por separado (en células aisladas, preparadas utilizando la sección 2 del protocolo) y realice mediciones solo en un canal espectral.
