Ensayo de inmunoprecipitación para estudiar las interacciones entre receptores enzimáticos y células transfectadas

Resumen

Fuente: Strazza, M., et al. Ensayo de coinmunoprecipitación para el estudio de las interacciones funcionales entre receptores y enzimas. J. Vis. Exp. (2018).

En este video, demostramos una técnica para realizar la co-inmunoprecipitación de proteínas PD-1 mutadas y de tipo salvaje marcadas con GFP utilizando perlas recubiertas con anticuerpos anti-GFP. Las proteínas PD-1-GFP unidas a perlas se incuban con proteínas SHP2 que interactúan con PD-1, lo que permite la identificación de motivos estructurales específicos en PD-1 que desempeñan un papel fundamental en la interacción de SHP2.

Protocolo

1. Inmunoprecipitación

>NOTA: Los siguientes pasos deben realizarse en hielo o a 4 °C.

1. Complementar el tampón de lisis (50 mM de Tris-HCl a pH 7,2, 250 mM de NaCl, 0,1% NP-40, 2 mM de EDTA, 10% de glicerol) con inhibidores de la proteasa (disolver 1 comprimido en 10 mL de tampón de lisis) y con 1 mM de ortovanadato de sodio. Agregue 500 μL de tampón de lisis helado a las células y retire y recoja las células de las placas inmediatamente con un raspador de células.
   nota: Es importante agregar el ortovanadato de sodio solo al tampón de lisis que se utilizará para las placas transfectadas con PD-1-GFP, ya que las placas transfectadas con SHP2 y las placas de control no transfectadas deben conservar la actividad de la fosfatasa.
2. Transfiera los lisados a tubos fríos de 1,5 mL y gírelos a 0,005 x g, 4 °C durante 30 min.
3. Para recoger el sobrenadante post-núcleo (PNS) de los lisados, se centrifugar los lisados durante 10 min a 10.000 x g a 4 °C y transferir los sobrenadantes a nuevos tubos. Deseche la bolita. Almacene los sobrenadantes del segundo conjunto de seis placas (Figura 1) en hielo para su posterior análisis de lisado de células completas.
4. Preparación de las perlas anti-GFP para la inmunoprecipitación de PD-1-GFP a partir de los lisados transfectados con PD-1-GFP del primer conjunto (cuatro placas) (Figura 1).
   1. Para evitar que se asienten las cuentas, agite suavemente la botella con las cuentas antes de abrirla. Retire 40 μL de las perlas anti-GFP de la suspensión por cada condición.
   2. Girar a 500 x g durante 3 min a 4 °C y retirar el sobrenadante para lavar las perlas.
      nota: Es importante minimizar el contacto entre las puntas de plástico de la pipeta y las perlas de agarosa para evitar pérdidas. Se recomienda cortar el borde de una punta de 200 μL antes de transferir las perlas a otro tubo.
   3. Vuelva a suspender las perlas en 80 μL de tampón de lisis (por muestra).
5. Añadir las perlas lavadas directamente al lisado celular (PNS) desde las células que expresan PD-1-GFP del primer conjunto (cuatro placas) (paso 1.3). Rotar a 0,005 x g durante 30 min a 4 °C para inmunoprecipitar las proteínas marcadas con GFP.
6. Lavar las perlas con 1 mL de tampón de lisis en frío (sin ortovanadato) 3 veces. Centrifugar el tubo a 2.500 x g durante 10 s.
   nota: Al agregar el tampón de lisis a las perlas, agréguelo directamente sobre las perlas sin tocarlas con las puntas. No es necesario pipetear hacia arriba y hacia abajo durante los lavados.
7. Igualmente, divida el lisado de la SHP2 activa del primer conjunto (una placa; paso 1.3) y agréguelo a tres tubos de las perlas lavadas que contienen PD-1-GFP (la WT PD-1-GFP y las dos mutaciones diferentes con deficiencia de fosfo, Y223F e Y248F). Agregue un tercio del volumen del lisado de las células no transfectadas al segundo tubo de las perlas WT PD-1-GFP. Deseche los dos tercios restantes.
8. Incubar las perlas durante 4 h a 4 °C con una rotación suave (0,005 x g).
9. Lave las perlas dos veces con 1 ml de tampón de lisis en frío (sin pervanadato ni ortovanadato), como se indica en el paso 1.6.
10. Añadir 80 μL de tampón de lisis (sin pervanadato ni ortovanadato) por muestra, asegurándose de que el volumen total de cada tubo sea de 100 μL (20 μL de perlas y 80 μL de tampón de lisis). Mezcle suavemente y transfiera 50 μL de cada tubo a dos tubos nuevos de 1,5 mL.
    nota: Después de este paso, habrá dos tubos llenos de una mezcla que contiene perlas y tampón de lisis. Uno de los tubos se utilizará para analizar la SHP2 coinmunoprecipitada por Western blot.

2. Análisis de Western Blot SHP2

1. Gira las cuentas y retira el sobrenadante.
2. Añadir 20 μL de tampón Laemmli 2x (ver Tabla de Materiales) a las perlas y hervir a 95 °C durante 5 min.
3. Mida la concentración de proteínas de los controles de entrada (segundo conjunto) utilizando un kit de BCA (consulte la tabla de materiales). Transfiera 30 μL de la muestra más diluida a un tubo nuevo. Diluir el resto de los controles de entrada con tampón de lisis a la misma concentración que la muestra más diluida y transferir 30 μL de cada uno de ellos a un nuevo tubo.
   nota: Después de este paso, habrá 4 tubos de 30 μL cada uno, a concentraciones de proteínas similares, que representan los lisados de controles de entrada.
4. Agregue volúmenes iguales de 2x tampón Laemmli a los lisados y hierva a 95 °C durante 5 min. Gire las perlas y cargue el sobrenadante en un 4-20% de gel a base de TRIS SDS-PAGE (consulte la tabla de materiales) para el análisis de Western blot. Además, cargue 50 μL de cada muestra del segundo conjunto.
5. Continúe con el análisis de Western blot.

Resultados

Figura 1: Condiciones experimentales y estrategia. GFP-PD-1 WT (tipo salvaje), GFP-PD-1 Y223F (mutante ITIM) o GFP-PD-1 Y248F (mutante ITSM) se expresaron en células HEK 293T que posteriormente se trataron con pervanadato. Las proteínas GFP-PD-1 fosforiladas recogidas por inmunoprecipitación de GFP se mezclaron con lisados de células que sobreexpresaban SHP2, y se registraron los niveles y la activ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Membranas de nitrocelulosa	General Electric	10600004
Microcentrífuga	Eppendorf	5424-R	1,5 ml
BCA	pescador	23225	Ensayo de ácido bicinconínico
Anti-SHP2	Santa Cruz	SC-280
Anti-GFP-agarosa	MBL (en inglés	D153-8
Anti-GFP	Roche	118144600
Anti-actina	Santa Cruz	SC-1616
Células HEK-293	ATCC	CRL-1573
Ortovanadato	sigma	S6508
Cóctel de inhibidores de la proteasa	Roche	11836170001	Libre de EDTA
Tampón de muestra Tris-Glycine SDS (2x)	Invitrogen	LC2676	Tampón Laemmli modificado
4-20% Mini geles de tris-glicina	Invitrogen	XP04205BOX	15 pocillos
Tripsina-EDTA (0,25%) Rojo Fenol	Gibco	25200114
NaCl	sigma	S7653	cloruro de sodio

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