Método basado en ELISA para analizar las interacciones entre las proteínas de cebo y presa

Abstract

Fuente: Singh, B. et al., Ensayos para estudiar el papel de la vitronectina en la adhesión bacteriana y la resistencia sérica. J. Vis. Exp. (2018)

Este video describe una técnica basada en ELISA que detecta las interacciones proteína-proteína entre dos proteínas midiendo la unión de la segunda proteína a la primera proteína inmovilizada. La segunda proteína unida se detecta utilizando anticuerpos específicos marcados con una enzima, como la peroxidasa de rábano picante.

Protocol

1. Análisis ELISA de la interacción entre el PH recombinante y el Vn

>NOTA: Es necesario incluir controles para excluir el enlace no específico. El factor humano H (FH) o la proteína de unión a C4b (C4BP) se utilizan como controles positivos y negativos, respectivamente.

1. Diluir cada una de las proteínas humanas (Vn, FH y C4BP) por separado a 50 nM en Tris-HCl, pH 9.0 (tampón de recubrimiento). Dispensar 100 μL de solución de proteínas en cada pocillo de una placa de microtitulación Polysorp. Cierre las placas con la tapa y guárdelas a 4 °C durante la noche (16 h) para facilitar la inmovilización de la proteína en los pocillos de las placas de microtitulación.
2. Deseche la solución de la placa de microtitulación inclinándola boca abajo sobre el fregadero y lave los pocillos tres veces con 300 μL de PBS/pocillo. Bloquee los pocillos revestidos durante 1 h en RT con PBS que contenga 2.5% (p/v) de BSA (PBS-BSA).
3. Después de retirar la solución de bloqueo, lave los pocillos tres veces con 300 μL de PBS que contengan 0,05% (v/v) Tween 20 (PBST) por pocillo. Añadir 100 μL de PH recombinante marcado con His de 50 nM a cada pocillo de muestra e incubar durante 1 h en RT. En los pozos de control, agregue solo 100 μL de PBS-BSA.
   nota: El gen lph que codifica PH de Hif se amplificó por PCR y se clonó en el vector de expresión pET26b que agrega una etiqueta 6× His en el extremo C de la proteína expresada. El vector recombinante se transformó en E. coli BL21(DE3) para su expresión. Se utilizó resina de Ni-NTA para purificar la proteína recombinante.
4. Deseche la solución de proteínas y elimine las proteínas no unidas lavando los pocillos tres veces con 300 μL de PBST por pocillo. Añadir 100 μL de PBS-BSA que contiene peroxidasa de rábano picante (HRP) anti-His pAbs conjugados (dilución 1:10.000) e incubar durante 1 h a RT.
5. Prepare 20 mM de solución A disolviendo tetrametilbencidina en una solución de acetona al 5% y metanol al 45%. Para preparar la solución B, disuelva 19,2 g de ácido cítrico en 1.000 mL de_H2O, ajuste el pH a 4,25 añadiendo KOH, luego agregue 230 μL de 30% de_H2O2. Almacene ambas soluciones en la oscuridad en RT. Justo antes de usar, mezcle 500 μL de solución B con 9,5 mL de solución A para preparar el reactivo de detección ELISA.
6. Lave los pocillos tres veces con 300 μL de PBST por pocillo y detecte los complejos antígeno-anticuerpo añadiendo 100 μL de reactivo de detección ELISA a cada pocillo.
7. Añadir 50 μL de 1 M H₂SO₄/pocillo para detener la reacción. Mida la densidad óptica de los pocillos a 450 nm utilizando un lector de microplacas.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sensores AR2G	Ciencias de la Vida de Pall	18-5095	Sensor a proteína inmovilizada por acoplamiento de aminoácidos
acetona	VWR	97064-786	Grado de análisis
Albúminas séricas bovinas (BSA)	Sigma-Aldrich	A2058	Apto para el cultivo celular
C4BP (proteína de unión a C4b)	Complemento Tecnológico, Inc.	A109	Comprado en forma líquida congelada
ácido cítrico	Sigma-Aldrich	251275-500G	Grado de la American Chemical Society (ACS)
Anticuerpos anti-His tag conjugados con HRP	Abcam	AB1269	Policlonal
C4BP	Complemento Tecnológico, Inc.	A109	Solución congelada
Columna de resina de afinidad con histidina (HisTrap HP)	GE Health Care Ciencias de la Vida	17-5247-01	Columnas preempaquetadas con Ni Sepharose
PH marcado por él			Expresado y purificado de forma recombinante en nuestro laboratorio
Metano	VWR	BDH1135-1LP	Grado de análisis
Plásmido que contiene C-terminal 6x His-tag en la red troncal (pET26(b))	Novagen	69862-3	Vector de ADN
Placas de microtitulación Polysorb	Sigma-Aldrich	M9410	Para ELISA
Tetrametilbencidina	Sigma-Aldrich	860336-100MG	Grado ELISA
Vitronectina (Vn) a partir de plasma humano	Sigma-Aldrich	V8379-50UG	Grado de cultivo celular