Ensayo de biosensores conductimétricos basado en β-lactamasas para interacciones proteína-proteína

Resumen

Fuente: Vandevenne, M., et al. El uso de un ensayo biosensor conductimétrico basado en β-lactamasas para detectar interacciones biomoleculares. J. Vis. Exp. (2018)

Este video muestra un ensayo de biosensor conductimétrico para estudiar la interacción de un anticuerpo con un antígeno objetivo inmovilizado en un chip transductor. El biosensor está diseñado para tener una proteína quimérica bifuncional: una enzima β-lactamasa con un sitio catalítico funcional fusionado a un nanocuerpo para unirse al antígeno objetivo inmovilizado. Al unirse, la hidrólisis catalítica de un sustrato antibiótico por la enzima β-lactamasa genera una señal eléctrica que confirma la interacción antígeno-anticuerpo.

Protocolo

1. Preparación de muestras de proteínas

1. Producir y purificar la proteína híbrida BlaP-cAb-Lys3 como se informó en nuestro estudio anterior. Almacene la proteína en 50 mM tampón de fosfato pH 7,4 con la siguiente composición: 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na₂HPO₄ y 0,24 g de KH₂PO₄ disueltos en 800 mL de agua destilada Fije el pH de la solución a 7,4 antes de ajustar el volumen final de la solución a 1 L. Filtre la solución de proteína.
2. Prepare una solución madre de lisozima de clara de huevo de gallina (HEWL). Disuelva 100 mg (40.000 unidades/mg) de HEWL comprado comercialmente en 10 mL de solución salina tampón de fosfato (PBS, consulte el paso 2.1.1). Esterilizar la solución proteica por filtración utilizando filtros con un corte de 0,22 μm.

2. Ensayos de biosensores

1. Preparación de la solución y del tampón
   1. Prepare 50 mM de PBS disolviendo 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de_Na2HPO₄ y 0,24 g de KH₂PO₄ en 800 mL de agua destilada. Ajustar a pH 7,4 con 1 N HCl o 1 N NaOH antes de ajustar el volumen de la solución a 1 L. Filtrar-esterilizar y almacenar a 4 °C.
   2. Prepare una solución de saturación/bloqueo disolviendo 3 g de hidrolizado de caseína en 100 ml de PBS preparado como se ha descrito anteriormente (véase el paso 2.1.1). Filtrar, esterilizar y almacenar a 4 °C.
   3. Prepare una solución aglutinante disolviendo 1 g de hidrolizado de caseína en 100 ml de PBS preparado como se ha descrito anteriormente (véase el paso 2.1.1). Filtrar, esterilizar y almacenar a 4 °C.
   4. Prepare una solución de lavado (0,1% Tween - PBS) añadiendo 100 μL de Tween 20 (100%) en 100 mL de PBS preparado como se ha descrito anteriormente (ver paso 2.1.1). Conservar a 4 °C.
   5. Prepare una solución de preparación de electrodos (Triton X-100 - PBS al 1%) añadiendo 1 mL de Triton X-100 (100%) en 100 mL de PBS preparado como se describe anteriormente (ver paso 2.1.1). Conservar a 4 °C.
   6. Prepare una solución de regeneración de electrodos (3,5 M de KCl) disolviendo 26 g de KCl en agua destilada hasta un volumen final de 100 mL. Filtrar esterilizado y almacenar a 4 °C.
   7. Prepare una solución de NaCl de 5 mM disolviendo 0,29 g de NaCl en agua destilada hasta un volumen final de 1 L. Filtre, esterilice y almacene a 4 °C. A continuación, prepare una solución de detección (4 mM de bencilpenicilina) disolviendo 26,7 mg de bencilpenicilina en 20 mL de solución de NaCl 5 mM. Filtrar, esterilizar y almacenar a -20 °C.
2. Preparación y regeneración de sensores
   nota: Los chips sensores recubiertos de polianilina fueron desarrollados y amablemente proporcionados por el Dr. P. Bogaerts, el Dr. S. Yunus y el Prof. Y. Glupczynski (Universidad Católica de Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne). La descripción del sensor, así como los protocolos de electropolimerización de polianilina utilizados para sintetizar estos sensores, se detallan en sus trabajos anteriores. En resumen, este sistema utiliza sensores reutilizables de ocho chips individuales que se fabricaron mediante técnicas clásicas de placa de circuito impreso (PCB). Los chips individuales están compuestos por tres puntos redondos de electrodo. El superior es el electrodo de trabajo en el que se electrosintetizó la polianilina. El del medio es el electrodo de referencia y el electrodo inferior constituye el contraelectrodo. Tanto el electrodo de referencia como el contraelectrodo se funcionalizan utilizando amalgama sólida de Ag/AgCl en la parte superior de la capa de carbono.
   1. Realice 3 lavados de los electrodos sumergiendo las puntas en los pocillos de una placa de 96 pocillos que contenga 300 μL/pocillo de solución de preparación de electrodos (Triton X-100 - PBS al 1%, consulte el paso 2.1.5.). Realice cada lavado durante 2 minutos con una mezcla suave a temperatura ambiente.
   2. Enjuague los electrodos sumergiendo las puntas en los pocillos de una placa de 96 pocillos que contenga 300 μL/pocillo de agua destilada durante 2 minutos con una mezcla suave a temperatura ambiente.
   3. Regenere los electrodos sumergiendo las puntas en los pocillos de una placa de 96 pocillos que contenga 300 μL/pocillo de solución de regeneración (3,5 M de KCl, ver paso 2.1.6) durante la noche a 4 °C o 1 h a temperatura ambiente.
   4. Realice 3 lavados de los electrodos sumergiendo las puntas en los pocillos de una placa de 96 pocillos que contenga 300 μL/pocillo de solución salina tampón de fosfato (consulte el paso 2.1.1.). Realice cada lavado durante 2 minutos con una mezcla suave a temperatura ambiente.
3. Ensayo de unión realizado en el sensor
   1. Cubra HEWL sobre la superficie de PANI (polianilina) del electrodo depositando una gota de 15 μL de 40 μg/mL de HEWL preparada en PBS sobre la superficie del electrodo. Incubar durante la noche a 4 °C o 1 hora a temperatura ambiente.
   2. Realice tres lavados de los electrodos con solución salina tampón de fosfato (consulte el paso 2.1.1) sumergiendo las partes del electrodo de los chips del sensor en los pocillos de una placa de 96 pocillos que contiene 300 μL/pocillo de solución salina tampón de fosfato. Realice cada lavado durante 2 minutos con una mezcla suave a temperatura ambiente.
   3. Sature los electrodos añadiendo una gota de 50 μL de la solución de bloqueo (ver paso 2.1.2) sobre la superficie del electrodo. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente. A continuación, lave tres veces como se describe en el paso anterior (consulte el paso 2.3.2).
   4. Diluir la solución de BlaP-cAb-Lys3 a 20 μg/mL en solución de unión (ver paso 2.1.3) y aplicar una gota de 15 μL de esta solución diluida sobre los electrodos. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente. Después de la reacción antígeno-nanocuerpo, lavar tres veces como se describe en el paso anterior utilizando la solución de lavado (ver paso 2.1.4). A continuación, enjuague el electrodo una vez con PBS (consulte el paso 2.1.1).
   5. Para la detección, conecte el chip del sensor a través de la parte del circuito de cobre a un multímetro digital. A continuación, inicie la respuesta del sensor aplicando una gota de 50 μL de solución de detección (véase el paso 2.1.7) sobre los electrodos positivos y aplicando una gota de 50 μL de solución de NaCl 5 mM sobre los electrodos negativos (véase el paso 2.1.7). Incubar durante 30 min a temperatura ambiente. Monitoree la conductancia con un multímetro digital.
      nota: El multímetro fue proporcionado por el Dr. P. Bogaerts, el Dr. S. Yunus y el Prof. Y. Glupczynski (Universidad Católica de Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne. Este potenciostato se controla por ordenador a través de un puerto USB y analiza los ocho chips diferentes del sensor simultáneamente. El software creado por Yunus y sus colegas crea un gráfico en tiempo real que representa las mediciones de la diferencia de conductancia entre los electrodos de referencia y de muestra en función del tiempo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivos
KH2PO4	Sigma-Aldrich	V000225
K2HPO4	Sigma-Aldrich	1551128
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
Tris–HCl	Roche	10812846001
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
Kcl	Sigma-Aldrich	P9541
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	NIST2186II
2-mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M6250
alanina	Sigma-Aldrich	A7627
HClO4	Fluka	34288	Solución 1M HClO4, distribuidor : Sigma-Aldrich
Hidrolizado de caseína	Sigma-Aldrich	22090
Bencilpenicilina sódica	Sigma-Aldrich	B0900000
Lisozima de clara de huevo de gallina	Roche	10837059001
heptano	Sigma-Aldrich	246654
metanol	Sigma-Aldrich	322415
Solución de hidróxido de amonio	Sigma-Aldrich	380539	28% NH3 en H2O, purificado por doble destilación (¿concentrado?)
Consumibles de laboratorio
Placa de 6 pocillos	Greiner Bio-One	657165	Placa CELLSTAR de 6 pocillos
equipo
Medidor de pH	WTW (en inglés)	1AA110	Medidor de pH de laboratorio inoLab pH 7110
Sistema de vacío y filtración	Nalgene	NALG300-4100	Portafiltros con receptor, distribuidor : VWR
Chips de sensores potenciométricos			fabricado por Yunus y colegas (ref 16)
PGSTAT30 Autolab	Metrohm Autolab		descontinuado, sucesor Autolab PGSTAT302N
Multímetro digital, METRAHit 22M	Gossen Metrawatt		descontinuado, sucesor Metrahit Base