Sonda de péptido biotinilado que penetra en las células para detectar interacciones proteína-proteína

Resumen

Fuente: Jaraíz-Rodríguez, M. et al., Péptidos biotinilados que penetran en células para estudiar las interacciones intracelulares proteína-proteína. J. Vis. Exp. (2017).

Este video muestra una técnica que utiliza péptidos biotinilados que penetran en las células para detectar interacciones intracelulares proteína-proteína. Los péptidos que penetran en las células facilitan que el péptido conjugado entre en una célula y se una específicamente a sus proteínas que interactúan. La biotina, después de unirse a la avidina, permite la purificación del complejo de proteínas que interactúan a partir de un lisado celular.

Protocolo

1. Células

1. Dos días antes de comenzar el procedimiento, coloque las células a la densidad requerida para que confluyan el día del experimento. Coloque las células en frascos o platos. Sin embargo, la extracción de proteínas será más fácil de los platos. Es conveniente preparar al menos 4 placas de 78^cm2 o 2 frascos de 150^cm2 por condición por experimento, para asegurarse de que los resultados sean consistentes.
2. En este estudio, se colocaron placas de GSC G166 humanas en 4 frascos de 150^cm2, cultivados en medio de células madre RHB-A suplementadas con 2% de B27, 1% de N2, 20 ng/mL de EGF y b-FGF según lo descrito por Pollard et al. Proceso en el que se alcanzó la confluencia. Por ejemplo, cuando se sembraron 5 x 10^{6 células} G166 en un matraz de 150^cm2, se procesaron 2 días después de la siembra.

2. CPPs biotinilados

1. Centrifugar los viales que contienen los CPP biotinilados liofilizados (BCPP) a 8200 x g durante 30 s, para evitar que quede parte del polvo en la tapa. Incluya un BCPP de control para asegurarse de que las interacciones encontradas son específicas de la secuencia objetivo. En este estudio, el BCPP control fue TATbiotina (TAT-B), y el BCPP tratamiento fue TAT-Cx43_266-283-B. Se podrían utilizar otros controles, como el TAT fusionado con fragmentos revueltos o mutados unidos a la biotina.
2. Disuelva los BCPP en el medio de cultivo correspondiente a la solución madre indicada por el fabricante; por ejemplo, para obtener una solución madre de 2 mg/mL de BCPP para tratar las GSC, añada 0,5 mL de medio de cultivo de GSC a un vial que contenga 1 mg de BCPP. Vértice y asegúrese de que el péptido esté bien disuelto.

3. Tubos

NOTA: Prepare al menos doce tubos de 1,5 mL por condición requerida en la Sección

1. Marque los primeros 3 tubos por condición. Tendrán el volumen total de lisados celulares obtenidos en el paso 6.4.
2. Marque una A en 3 tubos por condición. Estos tubos tendrán los primeros sobrenadantes obtenidos después de lisar e hilar los lisados celulares, paso 7.2.
3. Marque una B en 3 tubos por condición. Estos tubos tendrán una pequeña alícuota de los primeros sobrenadantes. Estos lisados servirán como muestras de Western blot en el paso 7.3.
4. Marque una C en 3 tubos por condición. Estos tubos tendrán los sobrenadantes obtenidos después del pull-down con NeutrAvidin, paso 7.7.
   nota: Esto es importante en caso de que el Western blot no mostrara ninguna señal de proteínas, lo que significa que las proteínas no se redujeron o se perdieron en algún paso del procedimiento. Si esta fuera la situación, repita el proceso para bajar las proteínas.

4. Tratamiento celular con los BCPPs

1. Aspirar el medio de cultivo.
2. Reemplace el volumen correspondiente de medio fresco requerido para incubar los BCPP en el menor volumen posible de medio de acuerdo con los tiempos de incubación. Es muy importante que, en cualquier caso, el medio cubra completamente toda la superficie de la placa/matraz para que las células no se sequen, por ejemplo, 6 mL por 150^cm2 para una incubación de 30 min.
3. Añada el volumen de la solución madre de BCPP a los cultivos celulares para alcanzar la concentración que se ha demostrado eficaz. En este estudio, se ha demostrado que 50 μM de TAT-Cx43266-283-B reducen la proliferación de GSC.
   1. Por lo tanto, agregue 92,8 μL de 2 mg/mL de TAT-Cx43_266-283-B (MW=3723,34 g/mol) por mL de medio de cultivo para obtener una concentración final de 50 μM de TAT-Cx43_266-283-B. Si el volumen a añadir es diferente para los péptidos de control, completar con medio de cultivo hasta el mismo volumen final. Por ejemplo, se añadieron 49,1 μL DE TAT-B (MW=1914,31 g/mol) más 43,7 μL de medio GSC por mL de medio de cultivo para obtener una concentración final de 50 μM DE TAT-B.
4. Coloque las células en la incubadora a 37 °C y 5% de CO₂ durante 30 minutos para asegurarse de que se produzcan las interacciones entre el BCPP y sus socios intracelulares. Si la interacción lleva más tiempo, incube durante más tiempo o ajuste los tiempos en caso de que el experimento haya consistido en un curso de tiempo. Además, la interacción de interés puede promoverse o prevenirse mediante la estimulación de diferentes vías de señalización intracelular.

5. Tampones y soluciones

1. Preparar PBS pH 7.4: 136 mM NaCl; 2.7 mM KCl; 7.8 mM Na₂HPO₄·2H₂O; 1.7 mM KH₂PO₄.
2. Prepare el tampón de lisis de proteínas: 20 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 137 mM de NaCl, 1% de IGEPAL, Antes de usar, agregue lo siguiente: 1/100 (v/v) Cóctel de inhibidores de proteasa, 1 mM de fluoruro de sodio, 1 mM de fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF) y 0,1 mM de ortovanadato de sodio.
3. Preparación del tampón Laemmli: (4x: 0,18 M Tris-HCl pH 6,8; 5 M glicerol; 3,7 % SDS (p/v); 0,6 M β-mercaptoetanol o 9 mM DTT; 0,04 % (v/v) azul de bromofenol (BB)).

6. Extracción de proteínas

NOTA: La extracción de proteínas se realizó como se describió anteriormente. Realice toda esta sección del procedimiento a 4 °C.

1. Aspirar completamente el medio de cultivo.
2. Lavar 3 x 10 mL con solución salina tamponada con fosfato (PBS) helada por 150^cm2 con mucho cuidado para evitar el desprendimiento de células.
3. Para obtener el lisado celular, agregue 3 mL de tampón de lisis por cada 150^cm2 y raspe completamente la superficie con un raspador celular. Inclinar la placa/matraz a unos 45 grados facilitará la recolección de los lisados celulares en sus tubos correspondientes.
4. Vierta 1 mL del lisado celular por tubo en tres tubos de 1,5 mL. Estos tubos se marcarán con la condición y se replicarán como se indica en el paso 3.1.

7. Desplegable

1. Centrifugar los tubos de 1,5 ml a 11.000 x g durante 10 min a 4 °C.
2. Transfiera los sobrenadantes a nuevos tubos (A).
3. Tomar una alícuota de este sobrenadante por condición a diferentes tubos (B), es decir, 50 μL por tubo. Añadir 4 tampones Laemmli (16,6 μL para 50 μL de lisado) y congelar a -20 °C. Estos lisados servirán como muestras habituales de Western blot.
4. Homogeneizar muy bien la NeutrAvidin Agarosa mediante una suave agitación. Corte las puntas de las pipetas para aumentar su diámetro y mejorar el pipeteo de las perlas. Añadir 50 μL de NeutrAvidin Agarose por mL de lisado celular en los tubos (A).
5. Incubar a 4 °C durante la noche con una agitación muy suave para permitir que NeutrAvidin interactúe con los BCPP unidos a sus socios intracelulares.
6. Centrifugar a 3.000 x g durante 1 min a 4 °C para recoger el complejo de NeutrAvidin con proteínas.
7. Retire con cuidado los sobrenadantes y transfiéralos a tubos limpios (C). Guárdelos para usarlos en caso de que el desplegable no tenga éxito.
8. Pasos de lavado: añadir tampón de lisis nuevo a los pellets (tubos A), resuspender por inversión y repetir los pasos 7.6 y 7.7 cinco veces más. Todos estos sobrenadantes se pueden descartar.
9. Retirar los sobrenadantes y añadir 2x tampón Laemmli hasta el volumen final deseado (40 μL por tubo de 1,5 mL para pellets obtenidos a partir de matraces de² cm de células confluentes).
10. Eluir a 100 °C durante 5 min para disociar las interacciones entre proteínas y centrífugar durante 30 s a 8.200 x g para pellets de perlas de NeutrAvidin.
11. Tomar los sobrenadantes, que contienen las proteínas disociadas, con puntas capilares a nuevos tubos (D). Las perlas se pueden conservar en caso de que se requieran repetir los pasos de elución.
    nota: Los sobrenadantes (tubos D) están ahora listos para ser cargados en Western blot o para congelarse a -20 °C.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Línea G166 GSC	BioRep
Medio de células madre RHB-A	Takara	Y40001
Proteína de ratón laminina	Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific	23017-015	10 μg/ml
B-27 Suplemento sin suero (50X)	Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific	17504-044	2%
Suplemento N-2 (100x)	Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific	17502-048	1%
FEAG humano recombinante	Peprotech	AF-100-15	20 ng/ml
b-FGF humano recombinante	Peprotech	AF-100-18B	20 ng/ml
PBS pH 7.4: En agua desionizada, 136 mM NaCl; 2.7 mM KCl; 7.8 mM Na2HPO4·2H2O; 1.7 mM KH2PO4
Tat	GenScript		Hecho a medida
TAT-B	GenScript		Hecho a medida
TAT-CX43266-283	GenScript		Hecho a medida
TAT-CX43266-283-B	GenScript		Hecho a medida
Pierce™ NeutrAvidin™ Agarosa	ThermoFisher Scientific	29200
Tampón de lisis de proteínas: 5 mM de Tris HCl (pH 6,8), 2% (p/v) de SDS, 2 mM de EDTA, 2 mM de EGTA
Fluoruro de sodio	PanReac AppliChem	141675	1 mM
Fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF)	Sigma-Aldrich	Página 7626	1 mM
Ortovanadato de sodio	Sigma-Aldrich	S6508	0,1 mM
Tampón Laemmli: (4x: 0,18 M Tris-HCl pH 6,8; 5 M glicerol; 3,7 % (c/v) SDS; 0,6 M β-mercaptoetanol o 9 mM DTT; 0,04% (v/v) azul de bromofenol (BB) .