1. Transformación de levadura
- Cosechar la levadura por centrifugación (en tubos de 50 ml) a 1.500 x g durante 5 min en RT. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender cada pellet en 5 ml de H2O estéril y aglomerar.
- Vuelva a centrifugar a 1.500 x g durante 5 min a RT y deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet de levadura en 1 ml de 1x LiAc/TE.
recién preparado y estéril
nota: Utilice células de levadura competentes dentro de 1 hora de la preparación.
- Prepare muestras de plásmidos (en tubos de 1,5 ml) añadiendo 200 ng de ADN plasmídico para transformaciones individuales, o 0,5 - 1 μg de cada ADN plásmido para cotransformaciones, y 100 μg de ADN portador de testículos de arenque (hervido durante 20 minutos y enfriado en hielo justo antes de su uso)
NOTA: Incluya un control positivo, por ejemplo, levadura cotransformada con pVA3 (que codifica para la fusión de ADN-BD GAL4 con la proteína p53) y pTD1 (que codifica para la fusión de GAL4 AD con antígeno T grande SV40).
- Añadir 100 μl de la suspensión de levadura competente recién preparada y 600 μl de 1x solución de LiAc/PEG (8 ml de stock PEG 3350, 1 ml de stock TE, 1 ml de stock LiAc) y vórtice durante ~30 seg. Incubar a 30 °C durante 30 min con agitación a 200 rpm.
- Añadir 80 μl de dimetilsulfóxido (concentración final del 10% v/v) y mezclar bien mediante una inversión suave. Choque térmico durante 15 min en un baño de agua a 42 °C mientras se mezcla cada 2 - 3 min.
- Enfríe la suspensión de la celda en hielo durante 2 minutos y centrifugue a 14.000 x g durante 15 segundos a RT para recuperar la levadura.
- Vuelva a suspender el pellet celular en 100 μl de 1x TE y coloque la placa en placas de medio SD mínimo apropiadas para el crecimiento selectivo (medio que carece de leucina y triptófano para mantener la presión selectiva tanto en el cebo como en los plásmidos objetivo).
- Incubar las placas boca abajo a 30 °C hasta que las colonias tengan ~2 mm de diámetro (generalmente 4 a 5 días). Las placas se pueden almacenar a 4 °C durante 2 a 3 semanas; para un almacenamiento más prolongado, haga las existencias de glicerol y almacene a -80 °C.
nota: Verifique que las proteínas de cebo y diana se expresen en la levadura mediante inmunotransferencia y que no tengan activación autónoma del gen reportero cuando se expresan por separado en la levadura.
- Añadir 100 μl de la suspensión de levadura competente recién preparada y 600 μl de 1x solución de LiAc/PEG (8 ml de stock PEG 3350, 1 ml de stock TE, 1 ml de stock LiAc) y vórtice durante ~30 seg. Incubar a 30 °C durante 30 min con agitación a 200 rpm.
- Añadir 80 μl de dimetilsulfóxido (concentración final del 10% v/v) y mezclar bien mediante una inversión suave. Choque térmico durante 15 min en un baño de agua a 42 °C mientras se mezcla cada 2 - 3 min.
- Enfríe la suspensión de la celda en hielo durante 2 minutos y centrifugue a 14.000 x g durante 15 segundos a RT para recuperar la levadura.
- Vuelva a suspender el pellet celular en 100 μl de 1x TE y coloque la placa en placas de medio SD mínimo apropiadas para el crecimiento selectivo (medio que carece de leucina y triptófano para mantener la presión selectiva tanto en el cebo como en los plásmidos objetivo).
- Incubar las placas boca abajo a 30 °C hasta que las colonias tengan ~2 mm de diámetro (generalmente 4 a 5 días). Las placas se pueden almacenar a 4 °C durante 2 a 3 semanas; para un almacenamiento más prolongado, haga las existencias de glicerol y almacene a -80 °C.
NOTA: Verifique que las proteínas de cebo y diana se expresen en la levadura mediante inmunotransferencia y que no tengan activación de genes reporteros autónomos cuando se expresan por separado en la levadura.
2. Ensayo de β galones de papel de filtro de elevación de colonias
- Prepare los siguientes búferes:
- Prepare un tampón Z que contenga 100 mM deNa2HPO4, 40 mM de NaH2PO4, 10 mM de KCl y 1 mM de MgSO4; ajuste el pH a 7,4. Esterilizar en autoclave y almacenar en RT.
- Prepare el tampón X-Gal disolviendo 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido a 20 mg/ml en N,N-dimetilformamida, y almacene en la oscuridad a -20 °C. Prepare la solución de tampón Z/X-Gal. Prepare el tampón antes de usar mezclando X-Gal a 0,33 mg/ml y β-mercaptoetanol al 0,27% v/v en el tampón Z. Utilizar 2,5 ml por muestra.
- Añadir 2,5 ml de solución de tampón Z/X-Gal recién preparada a una placa limpia de 100 mm y colocarla dentro de un papel de filtro de celulosa.
- Coloque un nuevo papel de filtro sobre la superficie de la placa con las colonias de levadura que se van a analizar. Frote suavemente el papel de filtro sobre la placa con pinzas y déjelo reposar durante ~ 5 minutos para que las colonias se adhieran.
nota: Procese el control positivo en paralelo, es decir, levadura co-transformada con pVA3 y pTD1.
- Levante el papel de filtro y sumérjalo (con pinzas) en un charco de nitrógeno líquido durante 30 segundos (el nitrógeno líquido debe manipularse con cuidado; use siempre guantes gruesos y gafas). Deje que el papel de filtro congelado se descongele a RT durante ~ 2 min.
- Coloque el papel de filtro (con la colonia hacia arriba) encima del papel de filtro previamente empapado dentro de la placa de 100 mm e incube a 30 °C.
- Revise periódicamente (cada ~ 30 min) la aparición de colonias azules.
nota: Cebo débil: las interacciones con el objetivo pueden tardar varias horas en producir una señal azul positiva (evite la incubación prolongada (>8 horas) que puede dar resultados falsos positivos). Para obtener los mejores resultados, utilice colonias recién cotransformadas, es decir, cultivadas a 30 °C durante 4 a 5 días, ~2 mm de diámetro.
