1. Celdas de enchapado
- Un día antes de la transfección, coloque 3,5 x 106 células HEK293T en 10 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) suplementado con un 10% (v/v) de suero fetal bovino (FBS) y un 1% (v/v) de penicilina/estreptomicina (10.000 U/ml de stock) por plato de 100 mm. Placa 3 - 5 100 mm2 placas por experimento/condición para asegurar una recuperación suficiente de proteínas.
nota: El número de placas debe determinarse para cada experimento/condición, lo que dependerá de los niveles de expresión y la solubilidad del complejo proteico de interés. Alternativamente, si se necesita una purificación a mayor escala, las líneas celulares se pueden adaptar para crecer en suspensiones en matraces giratorios, pero este método no funcionará para transfecciones transitorias.
2. Transfección de células o inducción de líneas celulares estables
- Al día siguiente, revise las células bajo el microscopio. Las celdas deben tener un 70 - 80% de confluentes antes de continuar.
- Transfectar las células con una mezcla total de 7 μg de ADN plasmídico y 21 μl de reactivo de transfección por placa de 100 mm. Transfectar células con un vector que exprese GFP (Tabla 1) como control de la eficiencia de la transfección.
nota: Si se utiliza una HEK293-T-REx o una línea celular estable similar que induce la expresión de dos o más subunidades complejas en respuesta a la doxiciclina, el inductor deberá añadirse a las células e incubarse durante 48 horas. Del mismo modo, también se requeriría una línea celular estable que induzca la expresión de GFP tras la adición del inductor con fines de validación. Continúe con el paso 2.7.
- Prepare la mezcla de transfección por plato de 100 mm. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, mezcle 500 μl de DMEM no suplementado con 7 μg de ADN plasmídico total (correspondiente a dos o más plásmidos). En un tubo de microcentrífuga separado, mezcle 500 μl de DMEM no suplementado con 21 μl del reactivo de transfección. Repita para cada reacción de transfección.
- Pipetear la solución de reactivo de transfección en la solución de ADN plasmídico (no mezcle las soluciones en el orden inverso). Mezclar pipeteando al menos 4 veces.
- Incube esta mezcla a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos, pero no más de 15 minutos.
- Incline la placa para crear un depósito de medios y pipetee cuidadosamente la mezcla de transfección gota a gota en el lado interior de la placa sin alterar las células. Regrese el plato a su posición plana original y revuelva suavemente para distribuir la mezcla.
- Incubar las células a 37 °C en una incubadora de cultivo celular humidificada con 5% de CO2 (esta condición se denominará en lo sucesivo "incubadora de cultivo de tejidos"). Reemplace el medio 5 horas después de la transfección (opcional).
3. Comprobación de la eficiencia de la transfección o inducción
- A las 24 horas después de la transfección, visualice las células bajo un microscopio fluorescente para verificar la eficiencia de la transfección (o la inducción de una línea celular estable de control HEK293T-REx que expresa GFP). Incubar durante otras 24 horas.
4. Purificación de afinidad STREP (STREP AP)
- Recolección de las células
- A las 48 horas después de la transfección, retire el medio y agregue 8 ml de solución salina fría 1x tamponada con fosfato (PBS). Pipetea hacia arriba y hacia abajo para separar las células de la placa.
- Recoja y transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 ml y centrifuga las celdas a 800 x g durante 4 min a 4 °C.
- Retire el sobrenadante PBS. Repita el centrifugado (800 x g durante 1 min a 4 °C) para eliminar cualquier PBS residual. Guarde el pellet celular a -80 °C para su uso futuro o siga el procedimiento que se indica a continuación para continuar con la purificación de proteínas.
- Lisis de las células
- Vuelva a suspender los gránulos celulares utilizando el 5× del volumen de gránulos celulares (~250 μl por placa) de tampón de lisis pasiva (PLB: 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM DTT, tableta de cóctel inhibidor de proteasa, 5% v/v glicerol y 1.0% NP-40) y transfiera la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 1.5 ml.
- Agite brevemente la suspensión y nutato durante 30 min a 4 °C.
- Gire la suspensión de celdas a 10.000 x g durante 10 min a 4 °C.
- Transfiera los lisados solubles a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y deseche los gránulos de celdas. Guarde el 10% del volumen final del lisado soluble como "STREP AP Input". Almacenar a 4 °C.
- Equilibrando las cuentas STREP
nota: ¡Utilice las cuentas STREP para el primer paso de AP! Los complejos reducidos con perlas STREP recuperan significativamente más proteínas que los extraídos con perlas FLAG.
- Extraer (n × 40 μl) + n μl de la suspensión de perlas STREP al 50% (n = número de muestras) y centrifugar a 1.500 x g durante 2 min a 4 °C.
NOTA: Utilice puntas de boca ancha para pipetear perlas.
- Retire el sobrenadante y añada 500 μl de PLB a las perlas. Nutar la mezcla de perlas durante 5 min a 4 °C. Girar a 1.500 x g durante 2 min a 4 °C.
- Repita para un total de 3 lavados. Vuelva a suspender las perlas en PLB hasta un volumen final de n × 40 μl.
- Añadir 40 μl de lodo de perlas STREP al 50% a cada muestra de lisado celular y nutato durante 2 horas a 4 °C.
- STREP AP
- Centrifugar la solución a 1.500 x g durante 2 min a 4 °C.
- Retire el sobrenadante y guárdelo como "STREP AP Flow-through (FT)" a 4 °C.
- Agregue 500 μl de STREP AP Wash Buffer I (20 mM de Tris-HCl pH 7.5, 250 mM de NaCl, 1.5 mM de MgCl2, 1 mM de DTT, 5% de glicerol y 0.2% de NP-40) a las perlas. Nutar la mezcla de perlas durante 5 min a 4 °C y centrifugar a 1.500 x g durante 2 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
- Repita para un total de 4 lavados.
nota: Antes del cuarto lavado, transfiera la solución de perlas a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para reducir el fondo de proteínas. Este paso es esencial.
- Añadir 500 μl de tampón de lavado II (100 mM de Tris-HCl pH 8,0, 150 mM de NaCl y 1 mM de EDTA) y equilibrar las perlas invirtiendo los tubos. Centrifugar a 1.500 x g durante 2 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
- Eluir la proteína de interés con 50 μl de tampón de elución STREP (100 mM de Tris-HCl pH 8,0, 150 mM de NaCl, 1 mM de EDTA y 2,5 mM de destiobiotina). Vórtice a 800 rpm durante 15 min a 4 °C.
- Girar las perlas a 1.500 x g durante 1 min a 4 °C. Recoger el sobrenadante. Esta fracción corresponde a la muestra "STREP AP Elution".
- Guarde la fracción de perlas a 4 °C para una segunda elución, que podría producir hasta la mitad de la cantidad de proteína obtenida con la primera elución. Alícuota del 10% de la elución STREP AP para la tinción de plata y/o Western blot.
- Equilibrando las cuentas FLAG
- Extraer (n x 16 μl) + n μl de la solución de perlas FLAG (n = número de muestras) y centrifugar a 1.500 x g durante 2 min a 4 °C.
nota: Use puntas de boca ancha para pipetear cuentas.
- Retire el sobrenadante y añada 500 μL de tampón de lavado FLAG (100 mM de Tris-HCl pH 8,0, 150 mM de NaCl, 1 mM de EDTA y 0,1% de NP-40) a las perlas. Girar a 1.500 x g durante 2 min a 4 °C. Repetir durante un total de 3 lavados.
- Vuelva a suspender las perlas en el tampón de lavado FLAG hasta un volumen final de n x 16 μl.
- Añadir 16 μl de la suspensión de perlas FLAG a la elución STREP AP restante y nutato durante la noche a 4 °C.
5. FLAG IP
- Gire la suspensión de perlas FLAG a 1.500 x g durante 2 min a 4 °C. Guarde el sobrenadante y guárdelo como "FLAG IP Flow-through" (FT) a 4 °C.
- Añadir 500 μl de tampón de lavado FLAG a la solución. Nutar durante 5 min a 4 °C y centrifugar a 1.500 x g durante 2 min a 4 °C. Repetir durante un total de 4 lavados y eliminar el sobrenadante después de cada lavado.
nota: Antes del cuarto lavado, transfiera la solución de perlas de proteína a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para reducir el fondo. Este paso es esencial.
- Retire el sobrenadante del centrifugado final y añada 30 μL de tampón de lavado FLAG que contenga 200 ng/μl de péptido FLAG en las perlas. Vórtice a 800 rpm durante 2 horas a 4 °C.
- Girar la suspensión a 1.500 x g durante 2 min a 4 °C. Coseche el sobrenadante y guárdelo a 4 °C como "FLAG IP Elution".
nota: Las muestras de elución pueden confirmarse mediante tinción de plata y/o Western blot utilizando protocolos estándar, y están listas para otros ensayos de proteínas. Al configurar un Western blot, ejecute todas las muestras siguientes: (1) Entrada STREP AP, (2) STREP AP FT, (3) Elución STREP AP, (4) FLAG IP FT y (5) FLAG IP Elution. Los volúmenes cargados tendrán que determinarse para cada experimento. Todas las muestras y perlas recogidas pueden almacenarse a 4 °C para el almacenamiento a corto plazo y a -80 °C para el almacenamiento a largo plazo. Las muestras de TAP podrían analizarse mediante espectrometría de masas para verificar la identidad de sus componentes, para identificar nuevas modificaciones postraduccionales (PTM) y/o para descubrir cualquier nueva interacción de proteínas con el complejo purificado. Para ello, después de aplicar un gel de coomassie o una mancha de plata, se pueden extirpar las bandas del gel con un bisturí limpio. Anteriormente se publicaron varias revisiones excelentes que discuten los métodos de espectrometría de masas.