$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Para el presente estudio, se ha utilizado una proteína de fusión de modificador similar a ubiquitina pequeña (SUMO) CVN en ensayos de inmunoabsorción enzimática en lugar de CV-N y es adecuada para ensayos basados en células. La proteína HA H3 recombinante de longitud completa del virus de la influenza A se obtiene comercialmente (consulte la Tabla de materiales) o se expresa en líneas celulares HEK293 de mamíferos y células de insectos infectadas con baculovirus de acuerdo con los protocolos estándar. La proteína de pico Wuhan-1 se expresa en células HEK293 de mamíferos. La síntesis de péptido monomanosilado (MM) y péptido dimanosilado (DM) permite la detección de ligandos homogéneos a CVN2 y moléculas pequeñas monomanosiladas.
1. Creación de construcciones CV-N
- Para cada una de las variantes de CVN2 y la proteína CVN2L0 (PDB ID 3S3Y), se obtiene la construcción génica con una secuencia líder pelB N-terminal y una etiqueta His en el vector pET27b(+) de fuentes comerciales (ver Tabla 1).
- Obtener CVN2L0 y sus variantes (V2, V3, V4 y V5; Figura 1A,C) en el fondo de un gen plantilla CVN2L0 que consta de dos secuencias de ADN distintas para cada repetición CV-N.
- Disolver el ADN plasmídico liofilizado en agua destilada desionizada estéril (ddH2O) hasta una concentración final de 100 ng/μL.
2. Preparación de placas LB-agar con células transformadas en ADN plasmídico
- Prepare el medio de cultivo LB-Lennox disolviendo 10 g/L de peptona, 5 g/L de extracto de levadura y 5 g/L de NaCl en ddH2O (ver Tabla de Materiales), y ajuste el pH a 7,4. Realizar la transformación en E. coli BL21 (DE3) competente para cada variante (V2-V5) por método químico siguiendo un informe publicado previamente.
- Divida la solución (900 μL y 100 μL), transfiera 100 μL en placas de agar LB (50 μg/mL de kanamicina) y use suavemente un esparcidor de células estéril. Incubar las placas de agar durante la noche a 37 °C.
3. Clonación
- Subclonar el gen para CV-N en los sitios NdeI y BamHI de pET11a (ver Tabla de Materiales) para su transformación (electroporación) en células electrocompetentes siguiendo la referencia.
4. Mutagénesis dirigida al sitio
- Generar CVN2L0 y CVN-E41A mutante en el fondo de un gen plantilla CVN2L0 que contiene dos secuencias de ADN distintas para cada repetición CV-N.
- Realice mutaciones utilizando un kit de mutagénesis dirigido al sitio (ver Tabla de Materiales) y cebadores mutagénicos específicos 5'-gagaaccgtcaacgtttgcgataacagagttcagg-3' y 5'-cctgaactctcttatcgcaaacgttgacggttctc-3' para ejecutar la PCR.
- Inicie una serie de reacciones de muestra utilizando múltiples concentraciones de molde de ADN bicatenario (dsDNA) que oscilan entre 5 y 50 ng (por ejemplo, 5, 10, 20 y 50 ng de molde de dsDNA). Mantenga constante la concentración de cebador.
nota: La mezcla de PCR y el protocolo de ciclo térmico se utilizan generalmente como se describe en el manual de instrucciones del kit de mutagénesis dirigida al sitio.
- Agregue la enzima de restricción DpnI (1 μL, 10 U/μL, consulte la Tabla de materiales) debajo de la capa de aceite mineral. Mezcle minuciosa y suavemente las reacciones, centrifugar en una microcentrífuga de sobremesa durante 1 minuto e incubar inmediatamente a 37 °C durante 1 h para digerir el dsDNA parental superenrollado.
5. Transformación de las células bacterianas
- Descongele suavemente las celdas supercompetentes XL1-Blue (consulte la Tabla de materiales) sobre hielo. Para transformar cada reacción de control y muestra, alícuota las celdas supercompetentes (50 μL) en un tubo de fondo redondo de polipropileno preenfriado (14 mL).
- Transfiera 1 μL del ADN monocatenario (ssDNA) tratado con Dpn I de cada reacción de control y muestra (ssDNA mutado) a alícuotas separadas de las células supercompetentes, que sintetizan la hebra complementaria. Agite las reacciones de transformación con cuidado para mezclar e incubar las reacciones en hielo durante 30 min.
nota: Antes de transferir el ADN tratado con Dpn I a la reacción de transformación, se recomienda eliminar cuidadosamente cualquier resto de aceite mineral de la punta de la pipeta. Como control opcional, la eficiencia de transformación de las células supercompetentes XL1-Blue debe comprobarse mezclando 0,1 ng/μL del plásmido de control pUC18 (1 μL) con una alícuota de 50 μL de las células supercompetentes.
- Aplique pulso de calor a las reacciones de transformación a 42 °C durante 45 s y, a continuación, coloque las reacciones en hielo durante 2 min.
nota: El pulso de calor aplicado ya ha sido optimizado para las condiciones mencionadas en tubos de polipropileno de fondo redondo (14 mL).
- Añadir 0,5 mL de caldo NZY+ (conteniendo por litro: 10 g de amina NZ (hidrolizado de caseína), 5 g de extracto de levadura, 5 g de NaCl, 12,5 mL de 1 M MgCl2, 12,5 mL de 1 M MgSO4, 10 mL de glucosa 2 M, pH 7,5, y precalentado a 42 °C) e incubar las reacciones de transformación a 37 °C con agitación a 225-250 rpm durante 1 h. cada reacción de transformación (5 μL de la transformación del plásmido de control; 250 μL de la transformación de la muestra) en placas de agar LB-ampicilina.
nota: Para los controles de transformación y mutagénesis, se esparcieron células en placas de agar LB-ampicilina que contenían 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido (X-gal, 80 μg/mL) e isopropil-1-tio-β-D-galactopiranósido (IPTG, 20 mM) (ver Tabla de Materiales). Inocular 50 mL de los cultivos celulares con una sola colonia de células de E. coli transformadas para purificar el ADN plasmídico mutado para su análisis. La mutagénesis se confirma mediante secuenciación de ADN en una instalación externa.
6. Expresión y purificación de proteínas
- Para un cultivo a gran escala, inocule una pequeña cantidad de LB (que contiene ampicilina) con una sola colonia de la placa transformada.
- Utilizando el cultivo nocturno, inocular el cultivo de expresión con aditivos, como 10 mM de MgCl2, 10 mM de MgSO4 y 20 mM de glucosa, diluyendo el cultivo de semillas a 1/100.
- Cultive las células con agitación vigorosa a 37 °C. Cultive las células a un Abs de 600 nm entre 0,4-0,6 (fase de mitad del registro) antes de enfriar las células a 20 °C. Induzca con 1 mM de IPTG y crezca durante la noche.
- A continuación, recoja las células centrifugando a 4.000 x g durante 15 min a 4 °C y deseche el sobrenadante con una pipeta.
- Vuelva a suspender el pellet de la célula en tampón de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y vuelva a centrifugar a 4.000 x g durante 15 min a 4 °C. A continuación, deseche el sobrenadante con una pipeta. Vuelva a suspender el pellet restante en 10 mL de tampón de lisis e incube la suspensión durante 1 h a 37 °C.
nota: Composición del tampón de lisis: (50 mM de NaH2PO4, 300 mM de NaCl, 2% Triton-X 100, 500 ng/mL de lisozima, 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 1 mM de ditiotreitol, 1 mM de MgCl2, pH 8, ver Tabla de Materiales).
- Someter la mezcla a dos ciclos de congelación-descongelación (-80 °C). Separe las fracciones solubles e insolubles por centrifugación a 4.000 x g durante 15 min a 4 °C y analícelas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), en particular, dodecil sulfato de sodio (SDS)-PAGE (Figura 1B, C).
nota: Las células pueden lisarse de varias maneras, como la congelación-descongelación, la sonicación, la homogeneización, la lisis enzimática o una combinación de estos métodos. Se recomienda la purificación a partir de cuerpos de inclusión para recolectar altos rendimientos de proteínas.
- Purifique las proteínas mediante cromatografía en columna de Ni-NTA (consulte la tabla de materiales). Cargue la fracción soluble en una columna de perlas de Ni-NTA regenerada (1 mL/min). Lavar el sistema con tampón TBS (50 mM de Tris, 150 mM de cloruro de sodio, pH 7,5) antes de iniciar un gradiente (0-100% 500 mM de imidazol en TBS durante 60 min) y recoger fracciones (1 mL/min). Diálisis de las proteínas purificadas para su caracterización bioquímica frente a 100 mM de PBS (Figura 1C, D).
- Alternativamente, use el gel de afinidad His-Select Ni2+ (ver Tabla de Materiales) en tubos de 14 mL para unir y resuspender el CV-N recombinante marcado con él en soluciones tampón con 20 mM de imidazol y 250 mM de imidazol, respectivamente. Incubar en tandas durante al menos 30 min.
nota: Aplique estas proteínas semipurificadas a una columna preempaquetada de un solo uso para el intercambio de tampón y la limpieza de muestras biológicas, por ejemplo, carbohidratos y proteínas, que pueden cargar 1-1,5 mL de eluido de cromatografía de afinidad de metales inmovilizados.
- Transfiera las soluciones proteicas a tubos de centrifugación con un filtro de corte de 10 kDa (ver Tabla de Materiales) y concéntrelas centrifugando durante 10 min a 4.500 x g y 4 °C. Para las mediciones de SPR, cambie las soluciones de analito por 10 mM de HEPES, 150 mM de cloruro de sodio, 3 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y 0,05% de Tween20, pH 7,4 (HBS-EP(+), ver Tabla de Materiales).
- Añada este tampón de funcionamiento SPR a un factor de dilución de 1:10 y centrifugue cuatro veces al volumen inicial durante 10 minutos a 4.500 x g y 4 °C.
- Determine la concentración de proteína a 280 nm utilizando un espectrofotómetro UV-Vis NanoDrop (ver Tabla de Materiales) basado en el coeficiente de extinción calculado (20.440 M-1 cm-1) para la proteína principal CVN2L0 que muestra un tamaño de 23.474 Da. Utilice PBS (100 mM, pH 7.0) o tampón SPR como blanco, y mida la concentración de proteína en tres pasos de dilución (1:1, 1:10 y 1:100).
7. Espectroscopía SPR
- Utilice el sistema SPR de doble canal (consulte la tabla de materiales) con tampón de funcionamiento HBS-EP(+) y 10 mM de glicina HCl pH 1,5-1,6 como tampón de regeneración. Encienda el instrumento, el desgasificador, el muestreador automático y la bomba, y lave todo el sistema con ddH20 durante 1 h. Coloque el tampón de funcionamiento listo para usar en una botella separada.
- Deje caer aceite de inmersión en el detector y monte un chip sensor de vidrio (consulte la Tabla de materiales) recubierto con una fina película de oro y en la parte superior funcionalizado con hidrogel de carboximetildextrano directamente en el detector debajo de la celda de flujo de tres puertos. Fije la configuración tirando hacia abajo del handling.
nota: C19RBDHC30M hidrogel de carboximetildextrano derivatizado de estreptavidina de 200 nm con una densidad media de proteína RBD biotinilada del síndrome respiratorio agudo severo coronavirus-2, es un chip sensor listo para usar con el ligando preinmovilizado.
8. Ensayo de unión SPR para la unión de CV-N a HA, proteína S y RBD
- Inmovilice los ligandos proteicos en chips sensores siguiendo los pasos a continuación.
- Abra una tabla de ejecución haciendo clic en Formulario en la barra de menú y en Editor de tablas de ejecución en el software integrado SPRAutoLink (consulte Tabla de materiales). Elija y haga clic en BASIC_Immobilization de la lista de tablas de ejecución disponibles y siga los pasos del procedimiento experimental en la pantalla de la computadora. El respectivo editor de muestras utilizado se muestra en la esquina superior derecha.
- Haga clic en Editor de conjuntos de muestras en la sección Formulario para completar la lista de reactivos de dos bastidores colocados en el muestreador automático para análisis adicionales. Haga clic en Autosampler Direct Control como una "Herramienta" en la barra de menú para llevar los racks hacia adelante o hacia atrás. Elija 4 °C como temperatura de funcionamiento.
nota: El software SPR permite el "Control Directo del Instrumento SPR" y el "Control Directo de la Bomba" mediante la selección de las herramientas correspondientes, así como el manejo del muestreador automático y haciendo clic en Formulario; también se puede elegir Ejecutar editor de tablas, Data-Plot o Post-Processing para realizar el análisis de datos. Los archivos se guardan directamente en el directorio predeterminado y se exportan como scrubber.files desde la ventana de posprocesamiento.
- Inicie la bomba para infundir ddH20 haciendo clic en Herramientas y control directo de la bomba y registre los datos haciendo clic en SPR Instrument Direct Control, y cada vez Inicie en las ventanas que aparecen recientemente. Coloque los reactivos de acoplamiento (paso 8.3) en viales de 300 μL, colóquelos en los bastidores del muestreador automático e inicie la tabla de ejecución haciendo clic en Run.
nota: Las superficies de las virutas están acondicionadas con 10 mM de tampón de glicina pH 9.0 o pueden haber sido lavadas con cloruro de sodio 1 M, tampón de borato de sodio 0.1 M pH 9.0 para acondicionar la superficie de la viruta derivada de carboxilo para la mezcla de activación EDC / NHS.
- Para esta simple interacción proteína-proteína, utilice el chip CMD500D (consulte la tabla de materiales) para generar una unidad de índice de microrrefracción (μRIU) = celda de flujo 2500 - 3000 con HA inmovilizado y μRIU = celda de flujo 400 con proteína de pico. A un caudal de infusión de 15 μL/min, inyectar una mezcla acuosa e igual de 0,4 M de Clorhidrato de N-etil-N'-(dimetilamino propilo) carbodiimida (EDC*HCl) y 0,1 M de N-hidroxisuccinimida (NHS) aplicando los siguientes pasos secuenciales.
- Rellene la bomba a 25.000 μL/min, realice el ajuste basal durante 30 s, inyecte 90 μL de solución de activación de muestras (EDC/NHS) durante 6 minutos de tiempo de contacto y, a continuación, manténgala pulsada durante otros 5 min.
- Repita este ciclo después de la línea de base durante 1 minuto a 10 μL/min solo en la celda de flujo izquierda (azul) para inyectar e inmovilizar péptidos sintetizados químicamente, HA y proteína de pico a 20 μg/mL, y permita el ajuste posterior de la línea de base con ddH2O durante 1,5 min antes de enfriar la superficie del chip activado con 1 M de etanolamina HCl pH 8,5.
- Cambie los tubos del muestreador de líquidos al desgasificador de ddH20 a la botella con HBS-EP(+) (Figura 2).
- Analice los sensorgramas SPR.
- Para realizar estudios cinéticos, utilice varias concentraciones de analito (10-5-10-8 M), con una etapa de regeneración después de cada inyección y mediciones en blanco después de diferentes analitos. Cambie el caudal a 10 μL/min e inicie las inyecciones con un tiempo de contacto de 4 min, luego una generación de referencia de 5 min y dos pasos de regeneración de 2 min cada uno con un intervalo de 30 s.
- Inyecte la solución tampón para mediciones en blanco cuyos sensorgramas se restan de las tiradas de muestras para normalizar diferentes concentraciones de proteínas.
- Haga clic en Formulario, desplácese hacia abajo y cambie a "Post-Procesamiento" haciendo clic en este modo de operación. Haga clic en Agregar para seleccionar las curvas de enlace generadas a lo largo del tiempo en el formulario de trazado de datos para cada celda de flujo y exportar la superposición como un archivo de depuración (.ovr). Haga clic en Archivo para abrir las opciones de guardado de archivos. Obtenga curvas de respuesta alineando las curvas izquierda y derecha y restando las señales del segundo canal de referencia de las del canal del ligando.
nota: Los datos se operan en "Post-Procesamiento" definiendo sensorgramas computacionalmente. Se coloca en una superposición de sensorgramas de las celdas de flujo izquierda y derecha, o se representa como sensorgramas a partir de la diferencia de ambos canales.
- Limpie todo el fluido con 50-100 mM de tampón de glicina pH 9.5, agua y 20% de etanol antes y después de las mediciones de unión para eliminar rastros de sal o cualquier contaminación de proteínas, o más estricto, con 0.5% de SDS y glicina.
nota: Para evitar daños en el instrumento, se recomienda verificar la estabilidad mecánica del chip de vidrio antes de volver a insertar el cartucho de chip en el instrumento si los chips se han almacenado bajo un tampón o con un 100% de humedad.
Tabla 1: Datos cinéticos obtenidos de sensorgramas SPR para la unión de las variantes de enlace CVN2L0 y Cys-Cys V2, V4 y V5 a HA utilizando un modelo de unión 1:1 de Langmuir. KD [M] = kapagado/kencendido o kd/ka. Todos los datos se generan a 25 °C en el tampón HBS-EP(+).
| Analito | ken [M-1*s-1] | Kdesactivado [S-1] | KD |
| CVN2L0 | 5.1 E3 | 1.3 E-3 | 255 nM |
| V2 | 4.0 E3 | 1.1 E-3 | 275 nM |
| V4 | 1.2 E3 | 1.3 E-3 | 11 μM |
| V5 | 1.2 E3 | 5.8 E-2 | 5 μM |
