Resonancia magnética nuclear para estudiar las interacciones proteína-proteína a nivel atómico

Resumen

Fuente: Winkelaar, G., et al. Medición de las interacciones de proteínas globulares y filamentosas mediante espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) y termoforesis a microescala (MST). J. Vis. Exp. (2018).

Este video describe la técnica de espectroscopia de resonancia magnética nuclear para estudiar las interacciones proteína-proteína entre ¹⁵proteínas envoplakina mutantes y de tipo salvaje marcadas con N y la proteína vimentina no marcada. La interacción exitosa entre la envoplaquina de tipo salvaje y la vimentina conduce a un amplio ensanchamiento de la línea y a la desaparición de picos en los espectros de RMN, mientras que la ausencia de una interacción entre la envoplaquina mutada y la vimentina da lugar a picos bien resueltos en los espectros de RMN.

Protocolo

1. Métodos de RMN

1. Preparación de muestras de RMN
   1. Purifique la proteína de tipo salvaje ¹⁵N o R1914E E-PRD utilizando 20 mM de Tris-HCl, 1 mM de DTT, pH 7. Las soluciones madre de proteínas suelen oscilar entre 0,3 y 1 mM con volúmenes de aproximadamente 1 mL.
      nota: La proteína se puede concentrar a >100 μM utilizando un dispositivo de ultrafiltración centrífuga MWCO de 3 kDa, 5 mL para llevar la concentración a un rango adecuado para la preparación de muestras.
   2. Purifique una muestra de proteína VimRod sin marcar con 20 mM de Tris-HCl, 1 mM de DTT, pH 7.
   3. En un volumen final de 500 μL, añadir la proteína E-PRD de tipo salvaje o mutante hasta una concentración final de 100 μM, el óxido de deuterio (_D2O) hasta una concentración final del 10% (v/v) y el DSS (ácido 4,4-dimetil-4-silapentano-1-sulfónico) hasta una concentración final de 20 μM. Aumentar el volumen de la muestra hasta 500 μL utilizando 20 mM de Tris-HCl, 1 mM de TDT, y pH 7. La preparación representativa de la muestra se describe en la Tabla 1.
      nota: La resonancia de 0 ppm de DSS se utiliza para calibrar los cambios químicos de ¹H, así como para la referencia indirecta de los cambios químicos de ¹⁵N de la proteína. D₂O se utiliza para la señal de bloqueo de deuterio para mantener el espectrómetro funcionando a un campo magnético neto constante.
   4. Prepare una segunda muestra de E-PRD, D₂O y DSS como en el paso anterior y agregue VimRod hasta una concentración final de 50 μM antes de aumentar el volumen a 500 μL.
   5. Transfiera las muestras de 500 μL a tubos de RMN de 5 mm de ancho para el experimento.

>2. Configuración experimental de RMN

1. Encienda el flujo de aire con el comando de expulsión "ej"; esto hará que la muestra salga del imán. Ahora, coloque la muestra dentro de un girador en la parte superior del imán junto a la abertura e insértela con el comando "ij". Espere hasta que la muestra se asiente dentro del imán antes de continuar.
2. Cree un nuevo conjunto de datos utilizando el comando "edc" y cargue los parámetros de RMN estándar ^{de 1}H seleccionando el experimento "ZGPR" (Figura 1). Rellene los campos NAME, EXPNO (número de experimento) y PROCNO (número de carpeta de datos procesados). Seleccione el disolvente en el campo "Establecer disolvente" y haga clic en "Ejecutar 'getprosol'" para leer el cabezal de la sonda estándar y los parámetros dependientes del disolvente (prosol).
3. Bloquee la muestra al disolvente deuterado, es decir, D₂O, utilizando el comando "bloquear" y espere hasta que termine de barrer y logre el bloqueo.
4. Corrija la frecuencia de resonancia del imán afinando la muestra usando el comando de sintonización automática "atma". Monitoree la curva de bamboleo hasta que se complete la sintonización automática.
5. Calce el campo magnético con TOPSHIM (comando "topshim"). El shimming es el proceso de ajustes de un campo magnético para lograr uniformidad alrededor de la muestra. Es una buena práctica almacenar los valores de correcciones de compatibilidad con el comando "wsh" y leerlos usando "rsh" antes de topshim, si se utilizan muestras iguales o similares.
6. Ajuste la ganancia del receptor con el comando "rga" para lograr la máxima relación señal-ruido.
7. Coloque el centro del espectro en el desplazamiento de resonancia del agua (o1) y ajuste el pulso de protones de 90 grados (p1) a alta potencia usando "calibo1p1".
8. Recoja el espectro de protones usando el comando zero go "zg" y procese con "efp" que incluye la multiplicación exponencial ("em"), la decaimiento por inducción libre (FID) que incorpora ensanchamiento de línea, la transformación de Fourier "ft" de FID y "pk" para aplicar la corrección de fase.
9. Aplique la corrección automática de fase "apk" y la corrección automática de línea de base "absn" utilizando la opción de polinomio sin integración.
10. Cree un nuevo conjunto de datos (como en 1.2.2) para el experimento SOFAST HMQC seleccionando "SFHMQC3GPPH" en el experimento.
11. Copie P1 y O1 optimizados del espectro de protones y rellene los pulsos dependientes de P1 mediante el comando "getprosol 1H p1 plw1", donde p1 es el valor P1 optimizado y plw1 es el nivel de potencia para P1.
12. Optimice la constante CNST54 para establecer el desplazamiento para el desplazamiento químico de amida y CNST55 para definir el ancho de banda con el fin de abarcar las regiones espectrales de interés, lo que permite optimizar la ganancia del receptor (Figura 2). Para seleccionar estos parámetros, extraiga el primer FID (decaimiento de inducción libre) del espectro bidimensional y busque la señal observada para definirlos. Además, varíe el retardo de relajación (D1), el número de escaneos (NS) y los escaneos ficticios (DS) para obtener una sensibilidad de señal aceptable con el comando "gs", que permite ir y escanear para monitorear la calidad de los datos en tiempo real.
13. Registre los espectros usando Zero Go "zg".

Tabla 1. Preparación de muestras de RMN.

muestra	1 mM E-PRD en tampón A (μL)	1mM VimRod en tampón A1 (μL)	Tampón A (μL)	200 μM DSS en D2O (μL)	Tampón B2 (μL)	Volumen total (μL)
E-PRD solo	50	0	50	50	350	500
E-PRD + VimRod	50	50	0	50	350	500
1Tampón A: 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7
2Tampón B: 23 mM Tris-HCl, 1,14 mM TDT, pH 7

Resultados

Figura 1: Captura de pantalla de la configuración del experimento de RMN. La ventana que se muestra se utiliza para configurar un experimento estándar para recopilar un conjunto de datos HSQC. Los parámetros del experimento se leen junto al experimento. El experimento ZGPR que se muestra se elige como experimento inicial para cargar los parámetros de protones estándar y dependientes del solvente. La ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cloruro de amonio (15N, 99%)	Laboratorios de isótopos de Cambridge	NLM-467	Marcaje de isótopos para RMN
D2O, óxido de deuterio (D, 99,8%)	Laboratorios de isótopos de Cambridge	DLM-2259	Preparación de muestras de RMN
DSS, 2,2-dimetil-2-silapentano-5-sulfonato-D6 (D,98%)	Laboratorios de isótopos de Cambridge	DLM-8206	Referencia para RMN
Tubos de RMN de precisión de 5 mm, 7" de largo	SJM/Deuterotubos	BOROECO-5-7	Tubos de RMN
Espectrómetro de RMN (14.1 Tesla)	Bruker		Adquisición de datos de RMN
Sonda criogénica TCI 5mm z-PFG	Bruker		Adquisición de datos de RMN
software
Bruker TopSpin 4.0.1	Bruker		Procesamiento de datos de RMN