Uso de la visualización de fagos para seleccionar proteínas con alta afinidad con una proteína objetivo

Resumen

Fuente: Zhang, W., et al., Uso de la visualización de fagos para desarrollar moduladores de variantes de ubiquitina para ligasas E3. J. Vis. Exp. (2021)

En este video, demostramos la técnica de visualización de fagos para aislar fagos prediseñados que expresan proteínas con alta afinidad por la proteína objetivo.

Protocolo

1. Preparar la biblioteca de fagos

1. Descongele la biblioteca de fagos en hielo y dilúyala a 100 veces la diversidad de bibliotecas en PBS. Por ejemplo, si la diversidad de la biblioteca es 1 x 10¹⁰ y la concentración de la biblioteca es 1 x 10¹³, diluya la biblioteca para que la concentración sea 1 x 10¹². Para las bibliotecas utilizadas aquí, dilúyalas 10 veces en PBS combinando 1 mL de la biblioteca con 9 mL de PBS.
   nota: La diversidad de la biblioteca debería haberse determinado durante la creación de la biblioteca y no se puede evaluar fácilmente de otra manera. La concentración de la biblioteca se puede determinar inoculando células de E. coli en la fase logarítmica media (OD600 0.6 - 0.8) y colocando en LB/carb.
2. Agregue 1/5 de volumen de PEG/NaCl. Por ejemplo, para 10 mL de la biblioteca previamente diluida, agregue 2 mL de PEG/NaCl.
3. Incubar en hielo durante 30 min.
4. Centrifugar a 11.000 x g durante 30 min a 4 °C, desechar el sobrenadante y volver a centrifugar durante 2 min para extraer el sobrenadante restante.
   nota: Coloque el tubo en el rotor en la misma orientación la segunda vez, ya que fue la primera para mantener el pellet en el mismo lugar, por lo tanto, para que sea más fácil de ver.
5. Vuelva a suspender suavemente el pellet de fago en 1 mL de PBT por proteína. Para cuatro proteínas, vuelva a suspender el pellet en 4 mL de PBT.
   nota: Procura no tocar el pellet y no introduzcas burbujas de aire.

2. Mostrar el fago a la(s) proteína(s) objetivo(s)

1. Control opcional: Agregue 100 μL de biblioteca de fagos a cada pocillo recubierto en la placa de control. Incubar a temperatura ambiente (~20-25 °C) durante 1 h con agitación orbital a 300 rpm y transferir la biblioteca de la placa de control a la placa objetivo.
2. Retire el tampón PB de la placa objetivo y añada 100 μL de la biblioteca de fagos a cada pocillo recubierto.
3. Incubar a temperatura ambiente (~20-25 °C) durante 1 h con agitación orbital a 300 rpm.

3. Eluir alrededor de un fago

1. Retire la biblioteca de fagos y lave los pocillos recubiertos cuatro veces con tampón PT. Invierta el plato y golpee una toalla de papel para eliminar las últimas gotas.
   nota: Si varias proteínas objetivo están recubiertas en una placa, intente minimizar el flujo de todas las soluciones subsiguientes entre los pocillos.
2. Añadir 100 μL de HCl 0,1 M a cada pocillo recubierto e incubar a temperatura ambiente durante 5 min con agitación orbital a 300 rpm.
3. Neutralice el pH añadiendo 12,5 μL de Tris-HCl 1 M (pH 11) a cada pocillo recubierto.
4. Agrupe el fago eluido de los 8 pocillos en un solo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Pipetear hacia arriba y hacia abajo durante la transferencia para que las soluciones sean homogéneas y aspirar todo el líquido de los pocillos.
5. Añadir un 10% de BSA al fago eluido combinado hasta una concentración final del 1%. Para un volumen de elución típico de una ronda de 950 μL, agregue 95 μL de BSA al 10%. Conservar a 4 °C. Esta es la salida de la primera ronda.

4. Preparación para las siguientes rondas de selección

1. Prepare un cultivo de semillas para cultivar la entrada de fagos para la siguiente ronda de selección, como se muestra en el paso 1.1.
2. Cubra la placa para la tercera ronda de selección como en el paso 1.2 con los cambios que se indican a continuación.
   1. Solo cubra cuatro pocillos por proteína en una placa de unión de 96 pocillos. Utilice la mitad del contenido de los tubos "redondos 2/3" o "redondos 4/5" para la ronda adecuada. Diluya el contenido de estos tubos según sea necesario, para evitar que las proteínas se asienten fuera de la solución.
3. Prepare la entrada de fagos para la siguiente ronda de selección.
   1. Utilice la mitad de la salida de la primera ronda para inocular 3 ml de células de fase logarítmica media. Para una salida típica de la ronda uno, inocule con 500 μL de la salida.
   2. Incubar a 37 °C durante 30 min con agitación orbital a 200 rpm.
   3. Añadir el fago auxiliar M13K07 hasta una concentración final de 1 x 10¹⁰ PFU/mL.
   4. Incubar a 37 °C durante 1 h con agitación orbital a 200 rpm.
   5. Transfiera los 3 mL completos de cultivo a 30 mL de 2YT/carb/kan. Crece durante la noche a 37 °C con agitación orbital de 200 rpm.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sistema de mini tubos Axygen (0,65 ml, estéril, 96/grada, 10 gradillas/paquete)	Fisher Científico	14-222-198	Artículos de plástico
BD Difco Medios de cultivo deshidratados: Caldo LB, Miller (Luria-Bertani)	Fisher Científico	DF0446-17-3	Preparación de las placas para la titulación
Albúmina sérica bovina (BSA), fracción V	BioShop Canadá	ALB001	Componente de búfer
Sal disódica de carbenicilina 89,0-100,5% anhidra	Millipore-Sigma	C1389-5G	Cultivo de células infectadas por fagomidos
Agitador de microplacas digital compacto	Fisher Científico	Teléfono 11-676-337	dispositivo
Cinta de sellado de aluminio Corning Microplate	Fisher Científico	07-200-684	Sellado de las reservas de glicerol de fagos
Agar deshidratado	Fisher Científico	DF0140-01-0	Preparación de las placas para la titulación
DS-11 Espectrofotómetro/Fluorómetro	DeNovix	DS-11 FX+	dispositivo
Microplaca Greiner Bio-One CellStar de 96 pocillos, sin tratar, con fondo en forma de U	Fisher Científico	7000133	Artículos de plástico
ácido clorhídrico	Fisher Científico	A144-500	químico
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R E. coli químicamente competente	Fisher Científico	C854003	Cepa bacteriana para la infección por fagos
Sulfato de kanamicina	Fisher Científico	AAJ1792406	Cultivo de células infectadas por fagos auxiliares M13K07
M13KO7 Fago Ayudante	Biolaboratorios de Nueva Inglaterra	N0315S	Permitir el empaquetamiento y la secreción de fagémidos
MaxQ 4000 Agitador orbital de sobremesa	Fisher Científico	11-676-076	dispositivo
Microplaca Nunc MaxiSorp de 96 pocillos, fondo plano	Tecnologías de la Vida	44-2404-21	Artículos de plástico
Solución salina tamponada con fosfato (PBS) 10X	Fisher Científico	BP3994	Componente tampón/medio de resuspensión de fagos
Películas de poliéster para ELISA e incubación	VWR	60941-120	Recubrimiento de las microplacas durante la incubación
Polietilenglicol 8000 (PEG)	Fisher Científico	BP233-1	Precipitación de fagos
cloruro de sodio	Millipore-Sigma	S3014	Precipitación de fagos
Tubos de cultivo de plástico estéril: polipropileno translúcido	Fisher Científico	14-956-1D	Cultivo de entradas de fagos
Clorhidrato de tetraciclina	Fisher Científico	BP912-100	Cultivo de células E. coli OmniMax
Base Tris	Fisher Científico	BP1525	Neutralización de la solución de fagos eluidos
Triptona en polvo	Fisher Científico	BP1421-2	Componente del medio de crecimiento celular
Preadolescente 20	Fisher Científico	BP337500	Componente de búfer
Extracto de levadura	Fisher Científico	BP1422-2	Componente del medio de crecimiento celular