Espectroscopía de fluctuación de fluorescencia para estudiar la homooligomerización de proteínas

1. FKBP12 F36V -mVenus Purificación

1. Células pLysS transformadas (DE3) con vector pET22b que contiene FKBP12F36V12 humano monomerizado y etiquetas N-terminales His6 y mVenus (vector disponible bajo pedido). Coloque las células en agar LB suplementadas con 50 μg/mL de ampicilina y 34 μg/mL de cloranfenicol.
2. Transfiera las colonias transformadas a 100 mL de cultivo iniciador LB y crezca durante 16 a 20 horas a 37 °C con agitación.
3. Diluir el cultivo iniciador denso (OD600 >1) 1:100 en medio LB (2 lotes de 500 mL) y cultivar durante 2 - 3 horas hasta OD600 = 0,6 - 0,8 (37 °C, 200 rpm).
4. Enfriar las culturas en el hielo. Inducir con 250 μM de IPTG y crecer durante 16 - 20 horas a 21 °C, 200 rpm.
5. Recolección de células por centrifugación a 2.000 x g durante 20 minutos.
6. Resuspender pellet en 40 mL de tampón IMAC A (20 mM de fosfato sódico pH 7,5, 500 mM de NaCl, 3 mM de imidazol, 1 mM de β-mercaptoetanol) suplementado con inhibidores de la proteasa sin EDTA (1 comprimido por pellet de célula).
7. Sonicar células (500 vatios, 20 kHz, 40% de amplitud, 9 s encendido, 11 s apagados durante 15 min) en hielo y cosechar material soluble por centrifugación a 20.000 x g.
8. Transfiera el lisado soluble a un matraz cónico y añada 2 mL de resina (ver Tabla de Materiales). Incubar durante 1 hora con rotación de 105 rpm
   nota: El níquel sefarorosa también se puede utilizar para este paso del IMAC.
9. Cosechar resina y lavar con 250 mL de tampón A de IMAC seguido de 500 mL de tampón B de IMAC (20 mM de fosfato de sodio pH 7,5, 500 mM de NaCl, 7 mM de imidazol, 1 mM de β-mercaptoetanol)
   nota: Aumente a 50 mM de imidazol si usa resina de níquel sefarosa.
10. Eluir la proteína marcada con His6 utilizando tampón C de IMAC (20 mM de fosfato de sodio pH 7,5, 500 mM de NaCl, 300 mM de imidazol, 1 mM de β-mercaptoetanol).
11. Inyectar en una columna de exclusión de tamaño (ver Tabla de Materiales) equilibrada en 10 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl y 1 mM DTT. FKBP12F36V tiene su elución máxima a 87,71 mL en la columna que utilizamos.
12. Evalúe la pureza a través de SDS-PAGE y agrupe y concentre según sea necesario.

2. Preparación de la matriz de placas multipocillos

1. Descongele el FKBP12F36V purificado (o la proteína etiquetada de interés) a partir de -80 °C.
2. Prepare una solución de FKBP12F36V purificada 100 nM (medio, 10 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT). Sonicado y centrífuga (centrifugado rápido de 13.000 rpm) para evitar la formación de agregados.
3. Pipetear 100 - 200 μL en una cámara de observación de 8 pocillos con fondo de vidrio.
4. Agregue el dimeriizador BB a concentraciones finales de 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 y 500 nM.
5. Como referencia, prepare una solución de 100 nM de mVenus solo para evaluar los posibles efectos de agregación y precipitación y recuperar un valor de brillo para el monómero con los mismos ajustes de adquisición.

3. Adquisición confocal sin calibración

1. Inicie el sistema confocal (Figura 1). Cualquier sistema confocal de microscopio de barrido óptico equipado con detectores digitales o detectores analógicos bien caracterizados, y capaz de mantener un tiempo de permanencia constante para cada píxel adquirido funcionaría.
2. Establezca la trayectoria del haz de excitación:
   1. Encienda el láser de 514 nm y ajústelo a 20 - 100 nW de potencia a la salida del objetivo (para FKBP12F36V-mVenus).
   2. Seleccione el objetivo 63X1.4NA o un objetivo de inmersión en agua con corrección de collar diseñado para FCS.
   3. Encienda un detector HyD, APD o PMT calibrado. Son preferibles los detectores capaces de contar fotones, ya que en este caso, el cálculo de S, desplazamiento y σ₀² son innecesarios.
   4. Seleccione la ventana de emisión de 520 a 560 nm
   5. Ajuste el orificio a 1 unidad Airy para la emisión correspondiente ~545 nm.
   6. Establezca el modo de adquisición en 16 x 16 píxeles
   7. Establezca el tiempo de _permanencia de píxeles t dwell de modo que satisfaga t_frame >> T_D >> t_dwell, donde T_D es el tiempo de residencia de la proteína difusora y t_frame es la velocidad de fotogramas. Esto correspondió a establecer el tiempo de permanencia en ~13 μs.
      nota: Algunos fabricantes comerciales tenían escáneres que no mantenían constante el tiempo de permanencia por píxel. Esta constancia es crucial para que el método funcione.
   8. Establezca el tamaño de píxel en ~120 nm.
   9. Seleccione el modo de adquisición xyt y seleccione el número de fotogramas que se adquirirán por adquisición y pozo (por ejemplo, 5.000).
   10. Si el sistema está equipado con un modo de alto rendimiento, introduzca las coordenadas de cada pozo y el número de adquisiciones por pozo para automatizar el proceso.
       nota: Tenga cuidado de asegurarse de la presencia de un dispensador de agua si utiliza un objetivo de inmersión.
   11. Si el sistema está equipado con un sistema de perfusión, cargue la solución BB y programe la perfusión para que comience justo después del fotograma 5000 para evaluar la cinética de la dimerización mientras adquiere, por ejemplo, 10.000 imágenes.
3. Agregue una gota de aceite en el objetivo de inmersión en aceite/agua si utiliza un objetivo de inmersión en agua con corrección de collar diseñado para FCS.
4. Monte la cámara de observación de 8 pozos en el escenario.
5. Seleccione el pozo correcto y concéntrese en la solución.
   nota: IMPORTANTE: Evite enfocar cerca del vidrio inferior para evitar reflejos y dispersión. Cuando profundice en la solución, desconecte la opción de enfoque automatizado.
6. Inicie la adquisición y guarde la pila de imágenes resultante en formato TIFF.

4. Análisis de tendencia y brillo usando el paquete R nandb

1. Como comprobación de calidad de preprocesamiento, utilice ImageJ para echar un vistazo a las imágenes y recuperar el perfil de intensidad, como se muestra en la Figura 2a. Esto es útil para determinar si se ha producido o no demasiado fotoblanqueo. Si hay demasiado blanqueo, los datos no son adecuados para un análisis posterior.
   nota: ImageJ también puede ser útil para convertir imágenes a TIFF desde formatos comerciales. El software nandb que se describe a continuación solo puede funcionar con archivos TIFF.
2. Descarga e instala R y RStudio. Lo mejor es descargar e instalar R primero, luego RStudio.
   nota: Lo que sigue es una descripción de cómo usar el paquete nandb R. No se requiere el conocimiento del lenguaje R para usar nandb, sin embargo, hará la vida más fácil.
3. Instale el paquete nandb.
   1. Abra RStudio y en la consola, escriba install.packages("nandb") y espere la instalación.
4. Conozca nandb
   1. Revisa el manual.
   2. Revise la ayuda integrada de RStudio para ver varias funciones. La función más probable que se utilizará será using will brightness(). Para ver el archivo de ayuda de esta función, escriba ? brightness() en la consola.
5. Calcular el brillo
   1. Digamos que uno tiene un archivo de imagen en el escritorio llamado img001.tif (tenga en cuenta que 'nandb' solo funciona con archivos TIFF). Se puede calcular el brillo de esa imagen:
      b <- brillo ("~/Escritorio/img001.tif", tau = "auto")
      1. Esto asigna el brillo de la imagen a la variable b en R. El tau = "auto" garantiza que la imagen se elimine correctamente antes del cálculo del brillo. Lo más habitual a partir de aquí es calcular el brillo medio o medio de la imagen. Se puede hacer esto escribiendo mean(b) o median(b). También se puede escribir la imagen de brillo en el escritorio usando
         ijtiff::write_tif(b, "~/Escritorio/whatever_img_name")
   2. Digamos que uno tiene una carpeta llena de imágenes images_folder en el escritorio y necesita calcular el brillo de estas imágenes y escribir las imágenes de brillo como archivos TIFF. A continuación, véase ?brightness_folder(). Esta función procesa una carpeta entera de una sola vez:
      brightness_folder("~/Escritorio/images_folder", tau = "auto")
      Esto es particularmente bueno para aquellos que tienen un software que prefieren R porque todos los archivos se procesan en un solo comando, y luego uno puede seguir trabajando con las imágenes TIFF de brillo de salida en el software elegido, ya sea ImageJ, Python u otro.

Figura 1. Aplicación de N y B para detectar transiciones de monómero-dímero de proteínas en solución. (a) Trayectoria óptica simplificada de un microscopio de barrido láser (LSM) equipado con una fuente láser (establecida a 514 nm en el caso de proteínas marcadas con mVenus) dirigida (flechas azules) hacia un objetivo de inmersión (en nuestro caso, un aceite de 63X1.4NA) que ilumina una solución de 100 nM de solución de FKBP12F36V-mVenus. La fluorescencia de emisión (flechas verdes) pasa a través de un espejo dicroico y se dirige hacia un filtro de paso de banda que limpia la luz de emisión, y un agujero de alfiler colocado en 1 unidad Airy situado justo antes de un detector digital puntual capaz de contar fotones. (b) Se escanea un volumen confocal de iluminación a través de 16 x 16 píxeles que iluminan moléculas individuales de FKBP12F36V-mVenus que entran y salen del volumen confocal de forma gaussiana produciendo una serie de fluctuaciones de intensidad de fluorescencia. c) Series de imágenes adquiridas a lo largo del tiempo

Figura 2. La eliminación automática de tendencias es necesaria para medir con precisión una población de monómeros en solución. (a) Se adquirió una pila de 5000 imágenes de 16 x 16 píxeles como se describe en la sección Protocolo. La intensidad del primer fotograma se muestra junto con el perfil de intensidad promedio resuelto en el tiempo, que muestra fluctuaciones a largo plazo que podrían estar relacionadas con el blanqueo y otros efectos solventes y/o fotofísicos. Cualquiera que sea la causa de estas fluctuaciones a largo plazo, afectan a los cálculos de brillo y, por lo tanto, requieren la eliminación de tendencias. Sin la desorientación automática, se obtiene B = 1,026, mientras que después de la destendencia automática, B = 1,005. Además, se muestra el brillo sin (paneles izquierdos, segunda fila) y con (paneles derechos, segunda fila) con filtrado suave. b) Se eliminaron las tendencias de los mismos datos presentados en el apartado a) y se mostraron los resultados en términos de intensidad y brillo.