$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Clonación
- Determine las configuraciones que se van a clonar y elija un vinculador. Marque las proteínas con los fragmentos en el extremo N o C como se describe a continuación para que no interrumpan su localización adecuada. Utilice un enlazador flexible como (GGGGS)x2.
- Marcar genéticamente las proteínas de interés para los fragmentos de PAmCherry1. Como opción, utilice los plásmidos de clonación enumerados en la Lista de materiales que contienen los fragmentos RN (residuos de PAmCherry1 1-159) y RC (Met más residuos de PAmCherry1 160-236) con secuencias MCS flanqueantes.
- Linealice los plásmidos que contienen los fragmentos RN y RC con PCR inversa (o digestión de restricción) en el punto de inserción. Los cebadores para la PCR inversa se enumeran en la Tabla 1. A continuación se muestra un ejemplo de protocolo de PCR utilizado en el laboratorio del autor (consulte la Lista de materiales para conocer los materiales exactos utilizados en este protocolo).
- Mezclar la reacción de PCR, hasta un volumen final de 50 μl con agua: a un tubo de PCR de pared fina, añadir el agua, 25 μl de mezcla maestra 2x, 0,5 μl de cada uno de los cebadores directo e inverso (20 μM de material diluido, 0,2 μM de concentración final) y 1 ng de plantilla. Utilice las siguientes condiciones de ciclo: 98 °C durante 30 segundos, 30 ciclos de 98 °C durante 7 segundos y 68 °C durante 2 minutos, y una extensión final a 72 °C durante 10 minutos.
- PCR los genes de interés para su inserción en los plásmidos linealizados que contienen fragmentos RN y RC. Realice la PCR como en el paso 1.2.1 con el tiempo de extensión a 68 °C. Utilice cebadores con voladizos que contengan una secuencia de enlazador flexible, como GGAGGTGGAGGTAGTGTGTGGAGGTGGAAGT para (GGGGS)x2, y homología de 15 pares de bases a los extremos de los plásmidos RN y RC linealizados para la recombinación.
nota: Los salientes de los cebadores para las proteínas de interés se presentan en la Tabla 2 si se utilizan los cebadores de la Tabla 1 para linealizar la columna vertebral del plásmido.
- Digiera la reacción de PCR con Dpn1 para eliminar la plantilla de PCR. Añadir 0,5 μl de Dpn1 (20 U/μl) directamente a los 50 μl de la reacción de PCR. Incubar a 37 °C durante 1 hora e inactivar con calor a 80 °C durante 20 min. Si la plantilla de fondo persiste en pasos posteriores, aumente la cantidad de enzima o alargue el tiempo de digestión.
- Purifique los productos de PCR a través de una columna de centrifugado según lo descrito por el fabricante.
- Realice una reacción independiente de la ligadura para combinar un plásmido linealizado que contenga un fragmento RN o RC con el gen de interés. Mida la concentración de los productos de PCR purificados: combine 50 ng de plásmido linealizado y 50 ng del gen de interés con 1 μl de premezcla de enzimas y lleve el volumen total a 5 μl con agua desionizada. Incubar a 50 °C durante 15 min, colocar en hielo y añadir 20 μl de tampón TE.
- Transforma plásmidos recombinantes en bacterias competentes.
- Seleccione 2-4+ colonias (según lo desee) para el cultivo O/N. Añadir 5 ml de caldo LB y 5 μl de kanamicina (50 mg/ml de caldo) en un tubo de polipropileno de fondo redondo de 14 ml, y añadir la colonia de bacterias seleccionada con un asa de inoculación esterilizada. Incubar a 37 °C O/N mientras se agita a 225 rpm.
- Congele 1 ml de cultivo O/N para el caldo de glicerol y miniprepare el resto según lo descrito por el fabricante.
- Realice la secuenciación para determinar un clon adecuado. Si utiliza los plásmidos de clonación de la Lista de materiales, utilice cebadores M13 hacia adelante e hacia atrás (en reacciones separadas) según sea necesario para obtener la secuencia completa de la construcción de fusión. Compare con la secuencia esperada utilizando una herramienta de alineación como BLAST del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) - http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi.
- Transfiera las construcciones verificadas por secuencia a un plásmido de expresión a través de una reacción recombinasa.
- Agregue 75 ng del plásmido de destino, como pcDNA para transfecciones transitorias o pLenti para empaquetamiento lentiviral, y 50 ng del plásmido de clonación recombinante a 1 μl de premezcla de enzimas y aumente el volumen total a 5 μl con agua desionizada. Incubar a 25 °C durante 1 hora, luego agregar 5 μl de tampón TE.
nota: Para el empaquetamiento lentiviral y la generación de líneas celulares estables, utilice un plásmido de destino diferente para cada construcción, por ejemplo, uno con resistencia a la puromicina y el otro con neomicina. Esto permite una doble selección de células transducidas. Considere también el promotor de cada uno, como el promotor constitutivo del citomegalovirus (CMV) para niveles altos de expresión, o el CMV con el operador TetO para la expresión regulada por doxiciclina sintonizable.
- Transformar 5 μl en bacterias competentes y minipreparar los plásmidos como en los pasos 1.2.6 a 1.2.8, pero utilizando el antibiótico adecuado (normalmente ampicilina).
- Determine la configuración óptima de BiFC.
- Plásmidos de expresión co-transfect en células U2OS (o célula de elección).
- Agregue 350 μl de DMEM sin fenol, sin rojo y sin antibióticos, suplementado con 10% de FBS en cada pocillo de un portaobjetos de 8 pocillos #1.5 con fondo de vidrio. Coloque una placa de aproximadamente 7,5 x 104 células por pocillo para que las células tengan aproximadamente un 70%-90% de confluentes al día siguiente.
- Al día siguiente de la siembra, co-transfecte plásmidos de expresión con diferentes configuraciones en cada pocillo utilizando el reactivo preferido y según lo descrito por el fabricante.
- Para cada pocillo, agregue 125 ng de cada plásmido de expresión en 50 μl de medio reducido sin suero en un tubo de 0,6 ml y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Añada 1 μl del reactivo de transfección por el centro del tubo y directamente en el medio. Agite suavemente para mezclar y deje reposar la reacción durante 30 minutos.
- Reduzca el medio en cada pocillo del portaobjetos de la cámara aproximadamente a la mitad. Agregue la mezcla de transfección gota a gota a los pocillos y agite suavemente para mezclar. Incubar las células a 37 °C y 5% de CO2 durante 24-48 horas. Cambie el medio el día después de la transfección.
- Imagen de células en un microscopio de fluorescencia como en el Protocolo 2 a partir del paso 2.1.4.
nota: La muestra puede ser fotografiada en un microscopio de fluorescencia estándar si los niveles de expresión son altos y la cámara es lo suficientemente sensible para la salida de fotones relativamente baja de PAmCherry1. Las moléculas reconstituidas de PAmCherry1 se pueden activar con un conjunto de filtros ultravioleta (405 nm) antes de la obtención de imágenes con un conjunto de filtros de excitación verde (561 nm).
- Cuando corresponda, cree un control negativo, por ejemplo, introduciendo una mutación puntual en una de las proteínas de interés que interrumpen la interacción. Realizar mutagénesis dirigida al sitio en el plásmido de clonación de la proteína a mutar y de la configuración elegida.
- Genere una línea celular estable empaquetando las construcciones en partículas virales e infectando las células U2OS (o la línea celular de elección). Considere un sistema de expresión inducible (tetraciclina) para que la expresión pueda ser inducida antes de la obtención de imágenes si la irreversibilidad prolongada de BiFC es un problema, o si se desea la expresión sintonizable.
cautela: El trabajo con virus se clasifica como Bioseguridad Nivel 2. Si bien las generaciones recientes de sistemas de empaquetamiento viral han reducido en gran medida la probabilidad de producir virus competentes para la replicación, aún existen algunos riesgos. Las referencias se pueden encontrar en http://www.cdc.gov/ biosafety/publications/.
- Repita el paso 1.2.10 utilizando un vector de destino lentiviral o retroviral. Aumente el cultivo de O/N a 100 ml para una preparación intermedia y una mayor pureza de los plásmidos.
- El día 1: Coloque aproximadamente 2 x 106 293T/17 celdas en un plato de 10 cm para cada construcción que se va a empaquetar.
- El día 2: Prepare una reacción de transfección utilizando un reactivo de transfección de su elección y según lo descrito por el fabricante.
- Prepare una premezcla de plásmidos de envasado con concentraciones finales de 250 ng/μl para el envasado de plásmidos 1 y 2, y de 100 ng/μl para el envasado de plásmidos 3 en agua estéril. Añada 10 μl de la premezcla de plásmido de empaquetamiento y 2,5 μg del plásmido objetivo a 1 ml de medio reducido sin suero en un tubo de fondo redondo de polipropileno de 5 ml y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Añada 20 μl de reactivo de transfección por el centro del tubo y directamente en el medio.
- Agite suavemente para mezclar e incubar a RT durante 30 min. Retire aproximadamente la mitad del medio de las células y agregue la mezcla de transfección gota a gota. Agitar suavemente para mezclar e incubar a 37 °C y 5% deCO2. Incubar 10 ml de medio por placa en un tubo con la tapa aflojada para el equilibrio de la temperatura y elCO2.
- El día 3: Cambie suavemente el medio con el medio preincubado y devuelva las células a la incubadora. Incube otro tubo de medio con la tapa aflojada. Nota: Los sincitios, o la formación de grandes células multinucleadas, pueden ser una señal de que el empaque va bien. Sin embargo, las células se encuentran en un estado frágil y se pueden desprender fácilmente. Al cambiar de medio, incline la pipeta para que quede horizontal y agregue el medio gota a gota en un borde de la placa.
- El día 4: Coseche el virus retirando el medio con una jeringa y filtrándolo a través de un filtro de tamaño de poro de 0,45 μm en un tubo limpio de 50 ml. Reemplace suavemente el medio con el medio preincubado.
- El día 5: Coseche de nuevo como se hizo anteriormente en el paso 1.5.3.3 y combine el filtrado común en el mismo tubo de 50 ml. Añadir 6 ml de concentrador de virus a cada tubo y mezclar. Almacenar a 4 °C durante al menos 24 horas hasta que el virus precipite.
nota: Dependiendo de la salud de las células, el virus se puede cosechar por tercera vez.
- Concentrar el virus centrifugando a 1.500 x g durante 15 min a 4 °C. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 250 μl de medio. Los virus pueden utilizarse inmediatamente para la infección o almacenarse en alícuotas de 50 μl a -80 °C durante un máximo de un año.
- Coloque alrededor de 3 x 105 5 células U2OS (o objetivo) por pocillo en una placa de 6 pocillos (2 ml de DMEM con 10 % de FBS por pocillo) para la infección, de modo que las células tengan aproximadamente un 50 % de confluentes en el momento de la infección.
- Al día siguiente, retire aproximadamente la mitad del medio para que quede aproximadamente 1 ml. Coinfectar con 50 μl de virus concentrado para cada constructo. Añadir 1 μl de policereno (8 mg/ml) a cada pocillo. Incubar a 37 °C y 5% deCO2. Cambie el medio al día siguiente e incube durante un día más antes de la selección del antibiótico.
nota: La cantidad de virus a añadir puede variar en función de la tasa de infección deseada. Los virus se pueden valorar mediante qRT-PCR.
- Agregue antibióticos para seleccionar las células infectadas. Se requieren pocillos separados con células no infectadas que no han visto el virus como canarios para probar la eficacia de la selección. Incubar durante 2-7 días, o hasta que se complete la selección.
nota: Las concentraciones efectivas deben ajustarse inicialmente, pero suelen ser de 1,0 μg/ml para la puromicina y de 1,0 mg/ml para la neomicina.
- Expanda las celdas en un plato más grande de 10 cm y proceda con el Protocolo 2.
2. Imágenes de células fijas
- Preparar una muestra para la obtención de imágenes
- Limpie un portaobjetos de cámara con fondo de vidrio # 1.5 de 8 pocillos agregando 250 μl de NaOH 1 M durante al menos 1 hora y lave a fondo con PBS.
nota: Los portaobjetos de cámara no tratados suelen dar lugar a una señal de fondo alta. Además, las células pueden ser sensibles al NaOH residual y la falta de limpieza a fondo de la superficie del vidrio (hasta 10 lavados) puede dificultar la adhesión de las células. Si es necesario, incube el portaobjetos de la cámara limpia con PBS O/N después del lavado. En el caso de las líneas celulares sensibles, la siembra a una densidad más alta (por ejemplo, con una confluencia inicial del 50%-60%) puede ayudar.
- Coloque una placa de aproximadamente 5,5 x10,4 células de expresión estable U2OS por pocillo en 350 μl de DMEM sin rojo de fenol con un 10% de FBS para que las células estén sanas y no confluyan en exceso al tomar imágenes.
- Realizar los tratamientos necesarios para el experimento, como la adición de tetraciclina para inducir la expresión de proteínas.
- Fije las células inmediatamente antes de la toma de imágenes.
- Antes de la fijación, prepare una solución fresca de paraformaldehído (PFA): 3,7 % de PFA en 1x PHEM con 0,1 % de glutaraldehído (GA). Para 10 ml de solución de PFA, pesar 0,37 g de PFA y transferirlo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 1 ml de agua destilada y 30 μl de NaOH 1 M y vórtice. Calentar a 70 °C y vórtice cada 1-2 minutos hasta que el PFA se disuelva por completo.
- Transfiera el PFA disuelto a un tubo cónico de 15 ml y agregue 3,8 ml de agua destilada, 5 ml de tampón PHEM 2x, 20 μl de glutaraldehído al 25% y vórtice para mezclar. Stock, el tampón 2x PHEM es de 120 mM PIPES, 50 mM HEPES, 20 mM EGTA y 16 mM MgSO4, con pH ajustado a 7.0 con 10 M KOH. Esta solución fijadora puede almacenarse a 4 °C durante varios días.
cautela: Tanto el PFA como el GA son peligrosos. Prepare la solución en una campana extractora y use el equipo de protección adecuado cuando manipule ambos productos químicos. Evite la inhalación o el contacto directo con la piel.
- Retire el medio de crecimiento. Lavar rápidamente con 500 μl de PBS y añadir 250 μl del fijador PFA por pocillo. Incubar las células durante 20 min en RT.
- Retire el fijador de PFA de la muestra y agregue 350 μl de PBS o tampón de imagen (100 mM de Tris con 30 mM de NaCl y 20 mM de MgCl2, pH 8,5) por pocillo.
- Partículas de oro Vortex de 100 nm para romper los agregados y agregar 35 μl por pocillo (dilución final 10x) para rastrear la deriva de la etapa durante la toma de imágenes.
- Adquirir imágenes
- Enciende el microscopio. Encienda los láseres de 405 y 561 nm, pero mantenga los obturadores (internos o externos) cerrados en este punto. Encienda la cámara EMCCD y deje que se enfríe. Asegúrese de que los filtros de 561 nm estén en su lugar.
- Abra el software de adquisición y establezca el tiempo de exposición en 100 mseg y la ganancia EMCCD en 300 (rango 1 – 1,000).
- Agregue aceite de inmersión al objetivo y asegure la muestra a la platina del microscopio.
- Con un campo brillante o el láser de 561 nm encendido (~1 kW/cm2 ), enfoca la muestra.
- Para obtener imágenes de Ras y otras proteínas de membrana, utilice un objetivo TIRF apocromático de 60X con una apertura numérica de 1,49 y coloque el microscopio en la configuración TIRF. Ajuste el láser de excitación para que esté descentrado al golpear la apertura posterior del objetivo TIRF; Esto hace que el láser se desvíe al llegar a la muestra. Siga ajustando el láser hasta que se alcance el ángulo crítico y el láser se refleje. Busque una celda para obtener una imagen con varias partículas de oro a la vista. Establezca una región de interés que encierre la celda (o una región dentro de la celda) y las partículas de oro.
Nota: TIRF disminuye la profundidad de penetración del láser de excitación y reduce la señal de fondo desenfocada. Además, es probable que la corrección de la deriva sea más precisa cuando haya más partículas de oro a la vista.
- Si está disponible, active el sistema de enfoque automático para corregir la deriva de la muestra en la dirección z. De lo contrario, ajuste el enfoque manualmente a lo largo de la adquisición si la imagen se desenfoca.
- Comience la adquisición con el láser de 405 nm apagado y el láser de 561 nm encendido (~1 kW/cm2) en caso de que ya se esté produciendo una activación suficiente (normalmente si los niveles de expresión son altos). De lo contrario, encienda el láser de 405 nm en la configuración de potencia de fábrica más baja (0,02 mW o 0,01 W/cm2) y aumente gradualmente (0,1 mW a la vez) según sea necesario hasta que haya varias decenas de moléculas por fotograma o para que las moléculas individuales estén bien separadas.
- A medida que continúa la adquisición de datos, aumente gradualmente la potencia del láser de 405 nm para mantener la densidad del punto aproximadamente constante. Nota: A una potencia de excitación inferior a 405 nm, ya se pueden activar algunos PAmCherry1. A medida que estas moléculas se fotoblanquean, la población de moléculas PAmCherry1 fotoactivables restantes disminuye, lo que requiere un mayor flujo de fotones para mantener la misma densidad de moléculas que emiten fluorescencia en cada fotograma.
- Continúe la adquisición de imágenes hasta que la alta potencia de 405 nm (2,5 – 10 W/cm2) no active más eventos de activación.
nota: El tiempo total de adquisición depende del nivel de expresión y de la eficiencia de la complementación.
Tabla 1. Cebadores para la clonación lineal de plásmidos que contienen fragmentos de PAmCherry1. Los plásmidos de clonación que contienen RN y RC se pueden linealizar con PCR inversa en el punto de inserción en el extremo N o C de los fragmentos. Las secuencias se enumeran de 5' a 3'.
delantero
| Secuencia de cebado (5' a 3') |
| Clonación de plásmido para inserción en N-terminal inverso | CATGGTACCGAGCTCCTGCAGC |
| RN en el extremo N hacia adelante | GTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAA |
| RC en el extremo N | GGCGCCCTGAAGGGCGA |
| Clonación de plásmido para inserción en el extremo C-terminal hacia adelante | TAAAAGGGGGGCGCGCC |
| RN desde el extremo C-terminal inverso | GTCCTCGGGGTACATCCGCTC |
| RC desde el extremo C inverso | CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG |
Tabla 2. Voladizos para cebadores de genes de interés que coinciden con los cebadores de la Tabla 1.
Los 15 pares de bases de homología para la reacción independiente de la ligadura se generan a partir de salientes de cebadores. Además, los voladizos incluyen la secuencia para un enlazador flexible (GGGGS)x2. En su lugar, la secuencia de enlazador flexible se puede agregar a los cebadores de la Tabla 1. Las secuencias se enumeran de 5' a 3'.
| Voladizos para los cebadores del gen de interés (5' a 3') |
| Inserción de N-terminal RN o RC hacia adelante | GAGCTCGGTACCATG |
| Inserción de N-terminal RN inversa | ACTTCCACCTCCACCACTACTACC
CACCTCCCGCCCTTGCTCAC |
| Inserción de N-terminal RC inversa | ACTTCCACCTCCACCACTACTACC
CACCTCCGCCCTTCAGGGCGCC |
| Inserción de terminal C RN forward | ATGTACCCCGAGGACGGAGGTGG
AGGTAGTGGAGGTGGAAGT |
| Inserción de terminal C RC hacia adelante | GACGAGCTGTACAAGGGAGGTGG
AGGTAGTGGAGGTGGAAGT |
| Inserción de terminal C RN o RC inversa | GCGCCCACCCTTTTA |