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1. Marcaje de SBDS-FlAsH con el colorante fluorescente FlAsH 4',5'-Bis(1,3,2 ditioarsolan-2-il) Fluoresceína
- Mezcle 3 nmol de la proteína SBDS-FlAsH (la etiqueta FlAsH corresponde al motivo de tetracisteína Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys modificado genéticamente en el extremo C-terminal de la proteína SBDS recombinante) con 3 nmol del colorante fluoresceína 4',5'-bis(1,3,2 ditioarsolan-2-il) en un volumen de 5 μl de tampón de anisotropía (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 10% glicerol, 5 mM β-mercaptoetanol).
- Deje que la reacción continúe durante 8 horas a 4 °C. Diálisar la muestra contra el tampón de anisotropía durante la noche para eliminar el colorante libre.
- Utilice la ley de Lambert-Beer para cuantificar el % de proteína marcada. Mida la absorbancia a 280 nm y 508 nm en un espectrofotómetro utilizando una cubeta de cuarzo de volumen adecuado. nota: Considere los siguientes coeficientes de absorción molar (M-1 cm-1):
Ecuación 1
- Calcule la concentración de la proteína SBDS-FlAsH marcada utilizando la Ecuación 2.
Ecuación 2
- Calcule la concentración de proteína SBDS total utilizando la Ecuación 3 sustituyendo el CSBDS-FlAsH calculado del paso anterior.
Ecuación 3
- Calcule el porcentaje de proteína marcada utilizando la Ecuación 4.
Ecuación 4
2. Experimentos de anisotropía de fluorescencia
NOTA: Los experimentos de anisotropía se realizaron en un espectrofluorómetro equipado con una caja de herramientas de polarización y la recolección de datos se realizó utilizando el programa de anisotropía proporcionado en el software del equipo. La longitud de onda de excitación se fijó en 494 nm con una anchura de banda espectral de 8 nm y la emisión se registró utilizando un filtro de paso de banda de 530±25 nm. Las mediciones se realizaron a 25 °C en una cubeta de 200 μl con una longitud de paso de 5 mm.
- En una cubeta de fluorescencia, coloque 200 μl de SBDS-FlAsH de 30 nM en un tampón de anisotropía y valore 2 μl de EFL1 de 30 μM. Mezcle bien y deje reposar la reacción durante 3 minutos antes de medir el valor de anisotropía.
- Repita el paso 2.1 hasta que se haya añadido un volumen total de 40 μl de EFL1.
3. Análisis de datos
- Ajuste los datos al modelo de enlace adecuado mediante un algoritmo de regresión de mínimos cuadrados no lineales. En la Tabla 1 se presentan las ecuaciones para los modelos de enlace más comunes.
- Evaluar el mejor modelo que describa la interacción entre las proteínas mediante la inspección de los residuos del ajuste. Apoye el modelo elegido con experimentos adicionales.
Tabla 1. Modelos comunes de unión de interacción proteína-proteína y las ecuaciones matemáticas que los describen.
